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1、农药残留快速检测新技术的研究进展摘要：农药残留的快速检测方法对食品安全、环境保护具有重要意义。本文综述了农产品中农药残留检测的各种检测新技术，对近年来出现的一些新技术和新动态作了简要介绍，总结了农药残留检测技术的发展方向。关键词：农药残留;检测技术;酶抑制;免疫分析;生物传感器1. 引言3农药在提高农作物产量和保证人类食物供给方面贡献巨大，但由于农药的过量使用和滥用，食品中的农药残留对人类健康造成的负面影响越来越明显，人类食入被农药污染的蔬菜食品后，残留在其中的农药会在人体内累积或富集，当富集到一定浓度时，将造成人体急性或慢性中毒。因此，发展快速、可靠、灵敏的食品蔬菜农药残留分析方法迫在眉睫。
2、农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术，它要求精细的微量操作手段，灵敏度高，特异性强。由于各类蔬菜食品样品组成成分复杂，而且不同农药品种的理化性质存在较大差异，因而没有一种多组分残留分析方法能够覆盖所有的农药品种。而且农药残留的检测方法大多以仪器分析为主，采用高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、气质联用、液质联用等。针对传统样品前处理存在的单个样品提取、净化时间较长，有毒溶剂消耗量大等问题，美国农业部农业研究服务中心于 2002 年首次公开发表一种用于农药多残留物检测的快速(Quick)、简便(Easy)、廉价(Cheap)、高效(Effective)、耐用(Rugged)、安
3、全(Safe)(QuEChERS)法1。随后这种农药多残留物快速检测技术不断得到发展和完善2-3，并在蔬菜、水果等食品中农药残留快速检测得到广泛应用，所用检测设备，除了 GC-MS，还包括 LC-MS、UPLC-MS/MS 等。鉴于常规检测所需仪器设备昂贵且庞大、笨重，需要熟练专业技术人员操作，只能在实验室内进行抽样检测，难以满足样品现场快速检测的要求，各国科技工作者还应用新原理、新技术试图研究开发出一系列特异性强、灵敏度高、方便快捷、准确安全、简单廉价的快速检测新方法。由于农药品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农产品中残留量很低，直接测定非常困难
4、。为此需对样品前处理技术、分析检测技术、快速检测技术进行改进、开发和研究。2. 农药残留快速检测技术近年来，一大批农药残留快速分析方法涌现出来，如酶抑制法、免疫分析法、生物传感器技术、生物活体测定技术、分子印迹技术等。2.1 酶抑制法酶抑制法是利用有机磷及氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死这一毒理学原理，将AChE 与样品反应，如果样品中没有农药残留或者残留量极少，AChE 的活性就不被抑制，反之，如果农药残留量比较高，AChE 的活性就会被农药所抑制。在酶反应试验中加入底物和显色剂
5、观察颜色的变化或测定某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断是否存在有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。目前，依据酶抑制法原理设计的农药残留检测方法主要有速测卡法（纸片法）、比色法（分光光度法）和胆碱酯酶生物传感器。经过多年的酶抑制法研究开发和实践应用，中国先后颁布了2个国家标准和1个农业部行业标准，其中GB/T5009.1992003蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测4提供速测卡法（纸片法）和比色法（分光光度法）2种快速检测方法，GB/T186302002蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法-酶抑制法5和NY/T 4482001 蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残留毒快
6、速检测方法6均为比色法（分光光度法）。2.2 免疫分析法免疫分析法是利用抗原与抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。抗原是能够引起免疫反应的分子，它是形成特异性免疫反应的必备条件。一个完整的抗原应包括 2 个基本性质：一是免疫原性；二是反应原性（又称抗原性或免疫反应性）。具备这 2 种性质为完全抗原，仅具有反应原性的物质称为半抗原。农药是典型的半抗原，只有反应原性而无免疫原性，不能诱导抗体产生，只有将它们与大分子蛋白质载体结合，才能刺激机体免疫系统产生抗体。抗原和抗体的制备是免疫分析的关键和基础的步骤。制备抗原时，如果农药分子自身带有供偶联的活性官能团（如氨
7、基、羧基等），则可将农药分子直接与蛋白质载体进行偶联反应，否则就必须对农药分子进行衍生化，接上供偶联反应的活性官能团以合成人工抗原。有许多因素直接影响到能否制备出高质量的人工抗原，如选择合适的中间体、活性官能团引入位点的选择、半抗原产物的分离、间隔臂的长短、半抗原与载体分子的偶联比等7。抗体制备主要有 3 种途径：动物免疫（多克隆抗体）、杂交瘤（单克隆抗体）技术和重组抗体技术。根据标记物的不同，目前用于农药残留分析的传统免疫分析法主要有 4 种：放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析/酶联免疫吸附分析(EIA/ELISA)、荧光免疫分析(FIA/PFIA)、化学发光免疫分析(CLIA)。其中，EI
8、A/ELISA是最为常用的农药残留检测方法。2.2.1放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）放射免疫分析法是使用以放射性同位素作为标记的抗原或抗体，用射线探测仪或液体闪烁计数器测定射线或射线的放射性强度，来测定抗体或抗原量的技术。徐德武等8以3H标记莠去津建立的放射免疫测定法对土壤中莠去津添加回收率，沙土的添加回收率为85.795.0，壤土的添加回收率为86.992.1，表明此法对快速检测土壤中莠去津的残留具有的理论基础。胡秀卿等9以14C-克百威建立了克百威的放射免疫测定法，方法最低检测量为0.175ng/ml，线性范围为0.2564000.0ng/ml。在线性检测范围内
9、,添加不同浓度克百威的蔬菜样品检测的批内、批间变异系数均小于10%，在甘蓝菜样品中的添加回收率试验回收率为93.0 %104.0 % ,变异系数为4.3 %11.5 %。并且认为此法用于测定蔬菜中克百威的残留是可行且可靠的。放射免疫分析法尽管灵敏度非常敏锐，但是需要昂贵的计数器，存在放射线辐射污染问题，因此在农药残留分析中受到一定限制，并逐步为其他免疫分析方法所取代。2.2.2 酶免疫分析/酶联免疫吸附分析(EIA/ELISA)EIA/ELISA 基本原理与 RIA 相同。将一部分抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，使另一部分抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原
10、或抗体既保留其免疫原性又保留酶的活性。在测定时，把待测的抗原或抗体和酶标抗原或抗体，按照不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体发生反应。用洗涤的方法将固相载体表面上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最终结合在固相载体上的酶量与样品中待测物的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为带有颜色的产物，由于产物的量与样品中待测物的量直接相关，因此，可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到较高的敏感度。具有高度特异性和灵敏度的 EIA/ELISA 特别适合农药残留分析，自 1983 年之后得到了快速发展，由于避免必须使用放射性物质进
11、行工作，而且可达到低检出限（最低检测限达到 10 -10 g/mL 的水平），成为农药残留检测最常用方法，并且被美国化学学会(AOAC)与气相色谱、液相色谱一同列为农药残留检测的三大支柱技术。初期的EIA/ELISA农药残留分析研究工作主要针对某一特定农药，即单目标进行分析10-11。到目前为止，可用 EIA/ELISA 进行单残留检测的农药有100 多种，涉及的农药不仅包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂和杀鼠剂，还包括动植物生长调节剂，农药品种包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、三嗪类等传统农药以及苏芸金杆菌、阿维菌素、伊维菌素、多杀菌素等生物农药。虽然国内外大多数 EIA/ELISA 农药
12、单残留分析仍然处于实验室研发阶段，但国外也有针对 40 多种农药开发出的商品化 EIA/ELISA 试剂盒在出售。例如，Watanabe等12开发并生产出一种商业免疫测定试剂盒，直接测定果汁中的杀虫剂吡虫啉。2.2.3 荧光免疫分析（FIA或PFIA）荧光免疫检测技术的基本原理是用荧光标记抗原，再用标记荧光的抗原与待测农药同相应抗体进行竞争性结合，检测溶液中游离荧光标记物含量。因为无需分离和酶显色步骤，FIA 分析时间较 EIA/ELISA 的短。荧光抗体检测法、吖啶橙免疫荧光法、荧光标记A蛋白(FITC-SPA)检测法等传统免疫荧光技术，主要凭借手工操作，效率低，且对结果的判定在一定程度上可
13、受主观因素的影响，近些年来，又建立了荧光激活细胞分类法、时间分辨荧光免疫分析法等新方法。Coons等13早在1941年就合成了异氰酸荧光黄(FIC)，能有效地标记抗体球蛋白而不损害抗体的活性，但标记困难，不易普及。其后，Riggs等14于1958年又成功地合成了异硫氰酸荧光黄(FITC)，它既易与免疫球蛋白形成稳定的结合物，又不影响抗体的活性，从而使得免疫荧光分析技术得到了迅速推广，几经改进简化，又出现了吖啶橙免疫荧光法(AOFA)和荧光标记 A 蛋白(FITC-SPA)检测等方法。2.2.4 化学化学发光免疫分析(CLIA)1977年，以色列Halmann等15通过探索非放射性免疫诊断技术，
14、利用化学发光的基础，先后将固相酶联免疫法与化学发光法结合起来，建立了化学发光免疫分析法(CLIA)。CLIA 具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。CLIA 应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。CLIA与放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比，具有无辐射、标记物有效期长并可实现全自动化等优点。CLIA 为兽医、医学及食品分析检测和科学研究提供了一种痕量或超痕量的非同位素免疫检测手段。化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发
15、光免疫分析法。不同化学发光物质的发光机理和发光性能不同。不同类型的化学发光免疫分析系统原理和方法各异，都要求方法、仪器、试剂三位一体，故在研究和生产上的应用难度较大。尽管如此，CLIA 在近 10 年来仍得到迅速发展，在很多环境监测研究中得到应用。但这种分析方法在农药快速检测中尚未得到广泛应用。2.2生物传感器生物传感器是将生物分子识别元件（敏感元件）和信号转换元件（换能器）紧密结合，从而检测目标化合物的分析装置。其基本原理为：待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信号，再经仪表放大和输出，从而达到分析检测的目的。2.2.
16、1 酶生物传感器（enzymesensor）酶传感器是发展最早，也是目前最成熟的一类生物传感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定出待测物浓度。此类传感器中以乙酰胆碱酯酶(AChE)的催化活性为基础的抑制型酶电极和有机磷水解酶(OPH)为基础的直接酶电极已大量用于有机磷的检测16-18。为了提高乙酰胆碱酯酶生物传感器的灵敏度，使其更有效地应用于有机磷农药的快速检测，可以选择鸡脑中的乙酰胆碱酯酶作为此类生物传感器的酶源19。2.2.2免疫生物传感器（immunosensor）免疫传感器是利用抗原和抗体之间的高度特异性，将抗原或抗体结合在生物敏感膜上，来测定抗体或抗原的浓度。免疫生物传感器包括三个基本部分，固定有抗原或抗体的基体的生物芯片部分，将抗体与被测物特异性结合产生的光、热、压力等物理化学信号转换
