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1、组蛋白甲基转移酶Smyd2通过克制IL-6和TF-的产生负调控巨噬细胞的活性背景：巨噬细胞在生长和分化中体现Syd。成果：myd克制巨噬细胞产生I6和TNF。结论:Sm2负调控M1巨噬细胞的极化。意义：这个发现对于理解巨噬细胞分化的调控具有重要意义，同步也为自身免疫疾病的治疗提供了新的视角。SE和MND构造域2（myd2),是组蛋白H3K和36特定甲基化转移酶，在心脏发育和肿瘤发生中发挥重要作用。然而,yd在免疫和炎症中的作用却鲜少报道。在此研究中，我们发现Smyd2负调控巨噬细胞的激活和M型巨噬细胞的极化。升高Smyd2的体现，涉及IL-6和TNF在内的促炎因子的体现则会受到克制,同步，重要
2、的MC-和共刺激分子等重要细胞表面分子的体现也会受到克制。高体现Smy-2的巨噬细胞上调TGF-的体现并下调L-6的分泌，从而克制h-1细胞分化，增进T细胞的分化。在巨噬细胞中，Smd特定地增进Tnf和I6基因启动子上的H3K36甲基化，克制这两种因子的转录同步克制F-B和ERK信号通路。我们的数据证明,在炎症中,Smyd-2调控Tnf和Il6启动子上H3K3二甲基化的表观遗传调控在调节巨噬细胞的活性中发挥重要的作用。 固有免疫是人体抵御细菌、病毒、寄生虫和真菌的第一道防线。当机体抵御外界病原菌时，固有免疫一方面被模式辨认受体激活。模式辨认受体由免疫细胞体现,辨认与感染病原体有关的病原有关分子
3、模式。Toll样受体(Ls）是一类典型的模式辨认受体,它们能增进巨噬细胞和其她吞噬细胞辨认入侵的病原体,并且诱导免疫应答，产生促炎因子和趋化因子。TL诱导多种信号通路，如N-B、MAPK通路，并能激活NFB、ERK、p38、cun等一系列转录因子和激酶。这些转录因子协同增进多种下游基因如F和I-6的体现,最后激活巨噬细胞。以解剖位置和功能表型为根据，巨噬细胞可分为多种亚型。定位于特定组织中的巨噬细胞有破骨细胞,肺泡巨噬细胞，组织细胞和库佛细胞。若以巨噬细胞的功能表型为根据，巨噬细胞可以分为典型方式活化的巨噬细胞(M1）和选择性通路活化的巨噬细胞。1型巨噬细胞产生大量的炎性细胞因子,其中涉及TN
4、和I-6等,并在清除多种病原菌和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。M2型巨噬细胞，具有抗炎特性,在伤口愈合、组织修复、血管生成、肿瘤发展和寄生虫感染的免疫应答中发挥重要作用。当有病原菌或有关的细胞因子的刺激时，巨噬细胞的活性和基因体现谱均有明显变化，且这些变化由基因、表观遗传和转录严风格控。巨噬细胞辨认和功能的紊乱也许导致克罗恩病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性肝炎等慢性炎症或自身免疫性疾病。越来越多的研究表白,表观遗传调控在巨噬细胞激活和功能性分化中起重要作用。真核染色体的基本单位核小体,由四个核心蛋白（A,H2S，H，H4）包裹146bp的NA片段构成。基因体现可由组蛋白翻译后修饰严风格
5、控。这些修饰涉及甲基化、乙酰化和磷酸化。异常的组蛋白修饰与多种人类疾病密切有关，同步也是某些炎症性或自身免疫性疾病的生物学诊断标志和治疗靶点。组蛋白赖氨酸甲基化是一种典型的翻译后修饰,涉及K、H37、3K36甲基化。H的三/二甲基化和H3K36的二甲基化与转录基因的激活有关，无论是H33的二甲基化还是H32的三甲基化都与相应基因的沉默有关。有报道称组蛋白赖氨酸甲基化在巨噬细胞的极化和激活中发挥重要的作用。也有文献报道H327的去甲基转移酶Jmj3在型巨噬细胞的激活中发挥重要作用。而另一篇文献却报道在LP诱导激活的巨噬细胞中，有一种保守的E构造域的H3K4组蛋白甲基转移酶Ash1l调控L-和TN
6、F-的生成。SMY家族涉及五个甲基转移酶，命名为my15。该家族涉及一种ET构造域,且被MYND构造域分为两个片段。文献报道,在肿瘤细胞增殖和心肌细胞成熟中Smd1-发挥重要的作用。在HSP9缺失的状况下,赖氨酸甲基转移酶Syd2，二甲基化H36，从而克制基因的转录。然而，在HSP9存在的状况下,Smy2转甲基给H3K4,使基因转录。此外,yd2不仅仅使组蛋白甲基化并且也能使非组蛋白甲基化。例如，肿瘤克制因子p53赖氨酸30位点的甲基化使它的功能受损，且视网膜母细胞瘤蛋白赖氨酸6位点甲基化会使它的靶基因受克制。一种近来的研究阐释免疫系统的细胞体现Sy2。然而，Sd2在调控免疫应答和炎症反映中的
7、作用仍未知。我们最初观测得到当LPS刺激巨噬细胞激活时，yd2的体现明显地下调，也就是说Smyd2负调控巨噬细胞的活性。我们的研究也证明了我们最初的。这证明Smyd2在巨噬细胞激活中是一种负调控因子。我们发目前原始巨噬细胞中,过体现的Smyd2可克制TNF-和I-6的体现。且数据表白Smd2通过克制34的三二甲基化,增进3K的二甲基化作用来调控TNF-和IL-的生成。此外，过体现的Smyd2减少NF-B的活性,诱导RelA结合在靶基因的启动子片段上。重要的是,变化巨噬细胞中Smyd2的体现,可有效调节T细胞(Teg）和Th-17细胞的分化。因此,我们的研究对于理解巨噬细胞分化的调控具有重要意义
8、，且为自身免疫性疾病的治疗提供新的角度。实验环节动物中国科学院上海实验动物中心购买5BL/6小鼠。小鼠被保存在无病原体的微振笼中,并且所有的实验小鼠均在8周龄。所有的动物实验均被苏州大学实验室动物护理和使用机构批准。巨噬细胞分离培养-收集小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，在巨噬细胞分化培养基中培养培养基的成分为：RPM1140（Initrog),1FBS，10单位/ml青霉素，10单位/ml链霉素,并添加100ng/l集落细胞共刺激因子,细胞以2106 /l(6孔板)的密度培养6天，且培养基在第三天更换。培养6天后,收集贴壁细胞并转染，24后收集细胞并用100g/lLPS刺激巨噬细胞激活。T细胞提纯用C
9、D4分离试剂盒纯化4T细胞。用AC进一步提取C5-T细胞，细胞的纯度大概为95%。T细胞和巨噬细胞的分化与培养在iTreg细胞分化（rhTGF-,3gml）或h-1细胞分化（I-6,1ng/ml;rhTG-1,3ng/m;antiL-4,1g/l；ati-IN,/l）的条件下,用CD3(3g/m)和CD28(2g/ml)的抗体刺激纯化的CD4+CD25细胞。并分别用md2质粒或者对照组突变型质粒以11的比例转染巨噬细胞并培养3到4天。质粒转染Smyd质粒(批号 n.M20022）和对照组质粒(批号 no.P00001）购至One。构建Smd2点突变的突变型，引物为:5CGAGGTGTTCACC
10、AGTTGACGCTCC; GAAGAGGGATAAGCTGAACACCCG。如前所述构建I和Tnf荧光报告基因质粒。Pg荧光对照质粒和内参TK质粒购自romea。用Il（5-CCTTAGATGGCGTTACCTAGCA-3;5-CCTCTAGGTTGAAAAGCTAAACAT-）和Tf的引物构建报告基因。所有构建的报告基因均用DNA测序验证。用小鼠巨噬细胞核转染试剂盒进行巨噬细胞转染。RA干扰特定的小鼠Smyd2小干扰RNA1,在目的基因中加入SMAR缺陷的鼠Sm2(catlog no26830）。乱序的RNA对照购自harmaco。另一种特定的my小干扰R购自Santa rziotehno
11、logy。用小鼠巨噬细胞核转染试剂盒转染iRNA双螺旋。实时定量PR用NA提取试剂盒（Qage）从细胞中提取总RNA,然后用逆转录试剂盒(io-ad）合成cDN，然后用ABI 70HT(Applied Bystem)实时定量C来检测基因的体现。其中，PCR所用的特定引物为：鼠 Smy1,5-TCAGGACCGGAGCTAC-35-GCTCCTTCCATTTGA-; Smyd，5-GCGACTGAATGTCAG-35CACAGCTCAGAT-3; Smyd3,CCGACCCTGGTTAC35CGTTGGAACAACAT-;Smyd4, 5GTGATGAATGATCTACC-35-CCCAGTTG
12、AAGAGGGAAGAA-3; myd5，5-GACCCCCAATAAGTG-35-ACCAGTGTCTGTT-3; IL6，5-TATCCTCTCCCCAATTCC-3 5-TTGGTCCTTGCCACCTC-3； F，5-CCCCACACTCGATCATCTTCT3 5-GTACACGTGGGCTACAG3;-cti,-TTCCACCTTCCAGCAGATGT3-AGCTCATAAGTCCCT-3。Weste Blot用涉及PMS和蛋白酶克制剂的放射免疫沉淀缓冲液裂解细胞。SD-PAGE分离裂解混合液,并通过蛋白免疫印迹分析。所用抗体Sy2，hosphoIK/,IK，hoso-I, I，p
13、sphop5,5,phopho-RK12,ER/， phospo-p38，p8,posphoc-Ju和 cJun均购自信号转导公司。抗-ai抗体购自igaAldric。富士l0发光成像仪曝光作用化学发光底物的印迹，并用mage软件绘图（国立卫生研究院)。ELS从R公司购买ELISA试剂盒检测培养基上清中,细胞产生的T-,IL6和I-17等细胞因子的水平。荧光素酶报告基因体现的分析批示剂pL3-liferase报告质粒与Prl-t-Rnlla-ciferase质粒（内参)共转染AW64.7巨噬细胞,并检测Smd和内参的体现。转染2h后，LPS刺激细胞。双荧光素酶报告系统检测荧光素酶的活性(Pro
14、mga）。荧光素酶检测实验拟定荧光素酶活性,从而拟定转染效率,统一数据。与对照组,实验组的比值成倍增长。P实验购买HP试剂盒(Mlliore)，按阐明书进行CI实验。实时定量PR分析免疫沉淀DNA和内参DA，用内参DNA来原则化成果。CP 所用抗体， Smd(catalo no.ab108), HK4me2 (catalog o. ab7766),3K4me3（caalog n.ab12209)，H3K27me3 (catalog no ab02）,和H36e(catalogn a9048)均购自 Abam。hI试剂盒Z-hPM(ctlog n.171)购自Milpe.如下启动子引物被CHI实验放大：Il6,-GTGGAT-3（正义链）5-GGGGGAAGTGGGAG-（反义链);Tn,
