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1、分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中,置37CM温箱中培养24小时， 长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣 状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见人量球形的分生 抱子。通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括孫菌，每菌只是众 多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞 类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种 病原的两种说法。真正真菌包扌舌霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多 细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的
2、真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为 前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、范子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌 等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包扌舌烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土 曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马 铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合 于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。在口常检 测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲密、谢瓦曲霉、赤曲霉、
3、Wallemia等在 PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配 方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯孫素50mg,蒸馆水1000ml;DG18 琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白腺5gzKH2PO41gzMgSO4-7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝 基苯胺l.OmL,琼脂15g,蒸馆水1000mLzPH6.5)上则正常生长，抱子、形态特征发育良好，而 且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养 各类样品中的密菌，将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特
4、别是对干燥食品、高糖食品、 淹渍食品等，更有必要同时采用M40Y或DG1&由于霉菌中很多种类不会产生有毒的孫菌毒素，危害较小,而有的菌株即使污染数量不 多，但其产生的霉菌毒素却危害较人，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的 是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此，国外有些研究者设 计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白 M 10g,柠檬酸铁饺0.5g,0.2%二氯硝基苯胺l.OmL,琼脂15g,蒸懈水1000mLzPH5.6)用于 分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲孫和寄生曲廊在AFP
5、A 上30C培养2-3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养 基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等，取得了满意的结果。因此，针对不同样品，有目的地 设计出相应的选择性培养基，以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。2接种方式接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法，但近来国际上有不 少学者认为毎菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了 人量比较试验后发现，对霉菌计数来说,涂抹法有以卜几方面优越于倾注法:培养出的每菌菌落数较多;培养所需的时间较短;霉菌抱子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。这杲因为绝人多数霉
6、菌是好氧的，在培养基表面生长快,发育好，而混在培养基中发育就受影响，而 且在培养基倾注时霉菌抱子易受热损伤。我们在自己的实验室也做了类似的比较试验，通过 对30种常见霉菌的试验证实了上述的结论。因此，我们认为，霉菌计数采用涂布法既准确又 省时，值得推广。3培养温度经对多种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现，人部分菌种的最适温度为2530C。但一些产曲密毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度，如黄曲霉35C、构巢曲鶴33C、烟曲霉37C、小抱子菌35Co因此，培养温度也应根据培养目的而定，一般情况卞都采用2528C培养,若有特殊培养目的，则应适当调节培养温度。4培养时间我们对30种常见霉菌的生长
7、速度作了调查，正常培养条件下，培养3-4天的菌落数与 57天的基本相同，但菌种的特征不明显，因此，如呆只要作霉菌计数，培养3-4天已基本达 到目的,但如果还要进一步分类鉴定，则需要培养更长的时间(7-14天)。必须特别注意的是, 有几类生长特别快、菌丝很多的菌，则必需在48小时以内计数，否则菌丝就会覆盖整个平皿, 无法准确计数。这类菌主要有:毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较人的样品，这 类菌污染较多，检测这类样品，应提早观察记录。5最适计数范围霉菌菌落由抱子和菌丝组成，相当扩散,在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重 叠，影响计数，但数量太少又会产生较人的误差，因此选择适当的棉释
8、度计数是保证结果准确 的关键坏节之一。我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含 有约106个/ml的抱子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将饱子悬液作10-1-10-6倍稀释，吸取不同桥释度的櫛释液接种于PDA,25C培养5天后计数。30种常见霉 菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10-50个菌落的棉释度 时的计数与显微镜计数结果最接近;有近一半的菌株，每个平板含50-100个菌落己较难计 数,而人部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较 人差别，因此，应尽量选择10-50个/平皿的棉释度进行霉菌计
9、数。而对上述提及的菌丝很丰 富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以 内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范I韦I,可在培养基中添加少量抗生素，如氯霉素 (50100mg/L),金霉素(20-100mg/L)z 庆大爲素(50mg/L), 土霉素(100mg/L)等。6霉菌检测过程中应特别注意的事项6.1由于霉菌检测所需的时间较长，中间又需要多次观察,因此实验前一定要作好实验 计划，明确观察记录的时间。6.2霉菌抱子通过空气传播，所以实验时应保持实验室平静，减少空气流通;操作时手脚 要快，动作要轻，特别是培养过程中，如果观察时动作过人,早期生长出的霉
10、菌泡子就会在培养 基内扩散,形成新的菌落，导致结果不准确。6.3实验前应认真做好全面的消毒工作，包扌舌操作人员手指、实验室空间、实验台等， 实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌，防止进一步扩散。6.4对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解，并作好相 应的防扩措施，防止污染其它物品。3.2.1涂片镜检分别取15羽鸡肺部或气囊有结节的病料，将结节用2片载玻片压碎后分开，再用蹑子调匀，革兰氏染色后盖上盖玻片，置高倍镜下观察。结果在暗视野下可见到人量的分隔菌丝，气囊上的结节除可见到菌丝外，还可以见到散在的蓝色球状抱子。3.2.2分离培养挑取典型病变结节接种于血液琼脂平板培养基
11、上，置于37 C温箱中培养。24 h后可见到小米粒大小的白色绒毛状菌落，48h后菌落增人，60 h后转为淡绿色,72 h后菌落转为暗绿色，一个星期后呈黑褐色4。用接种环挑取菌落涂片镜检，可见到曲霉菌的形态结构（菌丝有隔，末端膨人成球状，球上有小梗，有的梗上有抱子存在，状如花冠），符合曲孫菌的特点。根据实验室检查结果再结合病史调查、现场观察、临床症状及剖检变化，可确诊为禽曲鶴菌病。（一）直接检查是最简单而重要方法，浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑 置玻片上，滴加10%KOH,覆盖玻片微热熔化角质层，再将玻片压紧，用吸水纸吸去周怜I 多余碱液，在显微镜卞观察，见皮屑甲屑中有菌丝，或毛发内部
12、或外部有成串抱子，即可 初步诊断为癣菌感染，但不能确定菌种。深部感染真菌标本如痰，脑脊液亦町做涂片用革 兰氏染色（白色念珠菌）或愚汁负染色（隐球菌）观察形态特征。（二）培养检查本法 可确定菌种，辅助直接检查不足，通常用沙保氏培养基（2228C）,深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37C培养，或根据不同菌种运用不同培养基，如抱子丝菌可用胱氨 酸血液葡萄糖琼脂，必要时运用鉴别培养基和生化反应，同化试验等进行鉴定。（三）免 疫学试验近年来有许多方法用于检测深部感染真菌的抗体，作辅助诊断荚膜组织胞浆菌、 念珠菌、曲密菌。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体；而且许多真菌间抗原 性有交叉反应：有
13、的产生抗体后维护时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率，则必须 结合临床情况分析结果才能作出恰当的诊断。由于上述检测抗体受到许多因素的限制，及 深部真菌感染时，早期培养阳性率甚低，晚期则多于失去治疗时机，因此用免疫学方法从 血清或其他部位检测真菌抗原，对早期诊断具有重要意义。如乳胶凝集法检测新型隐球菌 病患者的荚膜多糖抗原，ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫荧光法检测饱子丝菌病患者的可溶性抗原等，均为早期，快速、特异的诊断方法。（四）动物试验 其些真菌对实验动物有致病性，如皮炎芽生菌，球抱子菌可在小白鼠，豚鼠体内生长，白 色念珠接种家兔小白鼠可发生肾脏脓肿致死。四、防治原则真
14、菌感染尚无特异预防，主 要注意公共卫生和个人卫生，碘化物治疗葩子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效。制霉素、灰 黄霉素、克霉呼（三苯甲霉哇）等外用或内服过癣症和白色念珠菌病等有较好疗效。近年 服道5-氟胞喘唳（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著。二性霉素B可用于深部全身真菌感染。玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态（如人分生抱子、小分 生饱子及葩子柄等），还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。1、钢坏法（1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察 真菌的生长形态（如大分生抱子、小分生葩子及抱子柄等），还可以随时观察其生长发育 的全
15、部情况，有利于菌种的鉴定。1、钢环法（1）材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环（带有缺口）、石蜡。（2）方法 用无菌蹑子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载 玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈 即被固定于载玻片与盖玻片之间。 用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。 培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。 置湿盒内，室温或37C下培养23d后，逐口观察，镜下可连续看到真菌生长过程 及菌丝、葩子等特征，一般7d左右即可长好。 也可不用小培养钢环，直接
16、将融化的培养基滴于无菌玻片上，待冷凝后从周边接种 材料，用盖玻片覆盖后培养，在显微镜下连续观察生长情况。（3）结呆：镜卜观察可见到有胞壁增厚的厚膜抱子及假菌丝。2、小块琼脂玻片培养法用无菌操作法将制好的待用琼脂平板用无菌接种针或接种环切成人约lcm2的方块，将 其放置于灭菌的载玻片上。将标本或待检菌接种于琼脂块四周边缘靠上方部位，然后用无 菌蹑子取一无菌的盖玻片盖在琼脂上。在无菌平皿内放入少量无菌水和一个无菌U形（或 V形）玻璃棒。将此载玻片置于玻璃棒上，盖上平皿盖培养。每口用肉眼和显微镜观察饱 子和菌丝的特点。涂片找真菌标准操作规程1检验目的：用革兰染色找酵母样菌，为临床感染的初步诊断和用药提供依据。2适用范围：各种涂片标本（主要如白带等）3检验原理3.1真菌的染色结构如革兰阳
