溶菌酶的制备及其性质

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1、实验七 溶菌酶的制备及其性质实验目的】同羧肽酶实验实验要求】同羧肽酶实验实验内容】1. 溶菌酶Y活性检测 酶活力测定方法 酶活力单位定义 比活力定义 蛋白含量测定方法2. 蛋清溶菌酶的提取每组45个新鲜鸡蛋 利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3. 溶菌酶的分离、纯化 利用各种方法，从上述提取液分离 每步纯化前蛋白纯度检测 分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4. 溶菌酶理化性质 溶菌酶的分子量测定 溶菌酶的等电点测定5. 溶菌酶的酶学性质在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km(2)初步确定溶菌酶的最适pH 初步确定溶菌酶的最适温度 提出最少两种溶菌酶的可逆抑制

2、剂并验证抑制类型 提出溶菌酶的激活性并验证(6) 溶菌酶的热稳定性实验原理】溶菌酶(lysozyme)是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1, 4-B -N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸和谷52氨酸，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的卜乙酰氨基葡萄糖(NAG)与N-乙酰胞壁酸35(NAM)间的B -1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有 较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50oC，最适PH为67左右。 在280nm的消光系数ai% 为13.0。该酶活性可被一些金属

3、离子Cu2+、Fe2+、Zn2+(10-510-3M)1cm以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+ (10-510-3M)、NaCl所激活。 溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%4%)和哺乳动物的乳汁是溶 菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、 消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因 此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50 层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。采用福

4、林酚法测蛋白含量，分光光度法 测定酶活性。【实验材料】1. 实验器材循环水式真空泵HSB-III;蛋白紫外检测仪；记录仪；紫外分光光度计；梯度混合器 (500mL); 721型光分光光度计；冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵； 圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6X50cm)(1.6X30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶 (1000mL)； G-3砂芯漏斗(500mL)2实验试剂 鸡蛋清(鲜鸡蛋) 底物微球菌粉D152大孔弱酸性阳离子交换树脂固体氯化钠(NaCl)；固体硫酸铵(NH) SO ；固体磷酸氢二钠(Na HP012H0)；4 24242固体磷酸二氢钠(Na

5、H PO2HO)；固体磷酸钠(Na PO )24234 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮(6) 溶菌酶标准品； Sephadex G50N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验 二） 聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1. 蛋清的制备将45个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8）,轻轻 搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.2. 鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀

6、后在不断搅拌下用lmol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。3. D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用lmol/L NaOH搅拌浸泡并 搅拌48小时，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗至近pH7.5,抽滤干，再用1mol/L HCl按上述方法 处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl ,用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH 之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶 液叩H6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。装柱：取直径1.6cm,长度为30cm

7、的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液， 关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至1520cm 高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5 为止，关闭柱子出口，保持液面咼出树脂表面1cm左右。 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内， 流速为1ml/min。 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检 验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱

8、液。 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇， 容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏 水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。（6） 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。4.Sephadex G50分子筛柱层析装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。（如果Sephadex G50是新的，则 按实验五中的方法处理凝胶）。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡, 装入玻璃层析柱（1

9、.6X50cm），柱床45cm。 上样：与实验五中的方法相同。 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流 泵，使流速为0.5mL/min,用部分收集器收集，每10分钟一管。 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析 膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。 透析除盐: 蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。5. 溶菌酶活力测定 酶液配制:准确称取溶菌酶样品5mg,用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶 液，再将酶液稀释成50Ag/ml.底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器

10、中）研磨2分钟， 倾出，稀释到1525ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.50.7范围内。5.3活力测定：先将酶和底物分别放入25 oC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入 比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL （相当于10临 酶），每隔30s读1次吸光度，至l90s时共计下四个读数。活力单位的定义是：在25C, pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1 个活力单位。酶的活力单位数二AA nm/1X 0.001450比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质6. 蛋白质含量的测定采用Folin-酚试剂法进行测定。（参见实验二

11、）7. 纯度检测采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。（参见实验六）8. 理化和酶学性质的测定学生可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案 进行探索研究。实验结果】总蛋白量 总活力 比活力步骤项目体积(ml)(mg)单 位(单位/mg)回收率(%)1.制备蛋清2. 溶菌酶分离3. D152树脂柱层析4. Sephadex G50层析思考题】1 请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理2根据自身的实验体会，写出优化本实验的措施。Experiment 19 Preparation of Lysozyme and Its Properties【Purp

12、ose】The same as carboxypeptidase Y experiment 【Requirement】The same as carboxypeptidase Y experiment 【Contents】1. Assay of lysozyme activity Method of enzyme activity assay. The definition of enzyme activity unit The definition of specific activity Lowry method to quantitate protein2. Extraction of

13、lysozyme form the egg white(1) Give every group 45 eggs Extract by some methods such as isoelectric point and resin chromatography3. Separation and purification of lysozyme(1) Separation lysozyme from above-mentioned solution by various methods.(2) Assay of protein purification before every step to

14、purify.(3) Assay of protein content and enzyme activity in every step.4. The physical and chemical properties of lysozyme(1) Assay the molecular weight of lysozyme.(2) Assay the isoelectric point of lysozyme5. The enzymatic properties of lysozyme(1) Calculate Vmax and Km of lysozyme(2) First make su

15、re the optimum pH of lysozyme(3) First make sure the optimum temperature(4) Propose at least two inhibitors of lysozyme and prove the inhibition style(5) Propose the activators of lysozyme and then prove them(6) Prove the stability of lysozyme【Principle 】Lysozyme, discovered by the Scottish bacteriologist Alexander Fleming in 1922, is an effective antimicrobial reagent and hydrolytic enzyme, whose full name is 1,4- B -N-lysozyme, also called muramidase. The active site of