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1、枯草芽孢杆菌产a-淀粉酶发酵试验化学与生命科学学院摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF7658）为实验菌株，通过种子扩大培 养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶 活，来初步估计发酵最佳时期和终点。关键词：枯草芽孢杆菌，a-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括a-淀粉酶、。-淀粉酶、糖化 酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生a-淀粉酶和异淀粉酶，其中a-淀粉酶又称 淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的a-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽 糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉a-
2、1， 6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的a-1，6-糖苷键，将 支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依 据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。实验材料和方法一、实验材料：（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF7658）（二）培养基：1、种子培养液葡萄糖1%Tryptone（胰蛋白月东）:1%,Yeast Extract（酵母提取物）：0.5%,NaCl（氯化钠）:1%调 pH7.2若配置固体培养基，则再加入1.5%琼脂。2、产淀粉酶发酵培养液玉米粉2 .0 %黄豆饼粉1 .5%CaCl 2 0 .02 %MgSO4
3、 0 .02%NaCl 0 .25%K2HPO4 0 .2%柠檬酸钠0 .2%硫酸铵0 .075%Na2HPO4 0 .2 %调节pH值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管二、实验1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。2、种子斜面及种子液准备-A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养 基，37，24h作菌种（3支/组）。-B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于 250mL 三角瓶中灭菌（100KPa 20min）。-C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37C 120r / min
4、振荡培养16h作种子液。（6瓶/ 组）3、发酵培养-按15-20%的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵 培养基的250ml三角瓶中。37C培养48h。-在无菌操作条件下，每4h取样2mL,测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。三、a淀粉酶活性测定上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。（2）吸取0.1mL标准糊精溶液，转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中，以此 作为比色的标准。（3）在比色管中加入2%可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL，在60C水浴 中平衡约5min，加入0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。（4）定时（15s）取出0.1
5、mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板 孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反应终点， 记录时间t四、计算酶活 计算淀粉酶活力酶活力（U/mL） =（60/tx20x2%xn）o0.5 式中t为反应时间（分），-n为酶液稀释倍数， 0.5是使用的酶液量（mL）, 20是可溶性淀粉溶液体积ml五、溶液配制碘原液：-1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml, 贮于棕色瓶中；0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）-称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1000mL，配好后用p
6、H计校正其pH至6.0。比色用标准碘液：-取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中；2%可溶淀 粉：-称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至透明（约 20min），冷却后加水定容至100ml。（当天配制）。标准糊精溶液-称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷却后加水定容到100ml结果a-淀粉酶产生的时间在上述培养条件下，12小时之前蛋白酶活力较低，36小时达到高峰，继续培养 至60小时，酶活逐渐下降，结果见表1。表a-淀粉酶活力与培养时间的关系.粒号pH；t发
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8、 徒 粉I_ w1srh3.2活l1-l6. 530. 5此西 3nL liti31 购*1rs?l.3?21-1-26. 270. 5mL徒ir 25n 11 ICT3.9?1-1-36.脂0- 254断玷淀 希1r甘1r o?r S. MH1H2-16. ST1aJ or ,1y irr2. W1-2-27.屿12,咐12*眺宣4411-3-36. 7312n ir1121 y2 M21-3-11r is111矿狎L舛11-3-2G. 5-1121酒11亍LS”2. 1731-3-30 7712! 30J 12. Z93a-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强，进入对数期后，酶活显著提高。 培养至36小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达 到高峰。参考文献1. 唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53 62-5363,53712. 陶文沂，桧山圭一郎，浜田信威，竹西繁行，冈田茂孝.枯草芽孢杆菌糖化型a-淀 粉酶的研究(I)糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化J.食品与生物技术学报, 1984, (02)
