第七章 双水相萃取

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1、第一节 概述基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗 粒尺寸的变化给固一液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子 强度等环境因素特别敏感，由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，而且大部分蛋白 质分子有很强的亲水性，不能溶于有机溶剂中，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有 机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离。因此基因 工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。 其中双水相萃取技术，又称水溶液两相分配技术是近年来出现的引人注目、极有前途新型分 离技术。双水相萃

2、取就是针对生物活性物质的提取所开发的一种新型液一液萃取分离技术。双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞 碎片时，还可以纯化蛋白质25倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在 收率上还是成本上都要优越得多见表 111 所示。双水相萃取法和传统的酶粗分离方法(如 盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以 -半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃 取纯化的比较见表112。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法，设 备需用量要少310 倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进 行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离

3、纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十 种，其分离过程也达到相当规模，如甲酸脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，半乳糖 苷酶的提取也到了中试规模等。近年来又进行了双水相萃取小分子生物活性物质，如红霉素、头抱菌素C、氨基酸的研 究和亲和双水相萃取的研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性；使双水相萃取技术具有 更大的潜力和宽阔的前景。双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的这 种现象被称为聚合物的“不相溶性”本世纪60年代瑞典Lund大学的AlbertssonPA及其同 事们最先提出双水相萃取技术并做了大量的工作。70年代中期西德的KulaMR和K

4、ronerKH 等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效 果。虽然双水相技术在应用方面取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验基础上，至今还 没有一套比较完善的理论来解释生物大分子在体系中的分配机理。1989年，Diamond等以 FtoryHuggins 理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但尚有局限性， 仍需继续探索，不断完善。双水相萃取技术真正工业化的例子也很少，其原因是成本较高，使它在技术上的优势被 削弱。双水相萃取中，原材料成本占了总成本的 85以上并且总成本随生产规模的扩大而 增加很多。因此产业化成了问题，若要发挥其技术优势，降

5、低原材料成本是关键。合成价格 低廉并且具有良好的分配性能的聚合物及将其从后续的操作过程中回收是双水相萃取技术 研究中的一个主要方向。一、双水相的形成在聚合物盐或聚合物聚合物系统混合时，会出现两个不相混溶的水相，典型的例 子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG )和葡聚糖，当各种溶质均在低浓度时，可以得到单相匀质 液体，但是，当溶质的浓度增加时，溶液会变得浑浊，在静止的条件下，会形成两个液层， 实际上是其中两个不相混溶的液相达到平衡，在这种系统中，上层富集了 PEG，而下层富 集了葡聚糖。4.9%PEG1.8% Dextran93.3% H2O2.6%PEG 7,3% Dextran 90.1%H2O

6、图5*9-15%葡聚糖500和3.5%聚乙二醇6000系统所形成的双水相的组成（W/V）（一）原理： 当两种高聚物溶液互相混合时，是分层还是混合成一相， 决定于混合时熵的增加和分子间作用力两个因素。两种物质混 合时嫡的增加与分子数有关，而与分子的大小无关。但分子间 作用力可看作是分子中各基团间相互作用力之和，分子越大， 作用力也越大。对高聚物分子来讲，如以摩尔为单位，则分子 间作用力与分子间混合的熵相比起主要作用。两种高聚物分子 间如有斥力存在，即某种分子希望在它周围的分子是同种分子 而非异种分子，则在达到平衡后就有可能分成两相，两种高聚 物分别富集于不同的两相中，这种现象称为聚合物的不相容性

7、 （ i ncomPatibihty ）。两高聚物双水相萃取体系的形成就是依据的这一特性。高聚物和一些高价的无机盐也能形成双水相体系，如聚乙二醇与磷酸盐、硫酸按或硫 酸镁等，其成相的机理尚不十分清楚，但一般认为是因为高价无机盐的盐析作用，使高聚物 和无机盐分别富集于两相中。在双水相体系中，两相的水分都占 85 一 95 % ，而且成相的高聚物和无机盐一般 都是生物相容的，生物活性物质或细胞在这种环境中不仅不会失活，而且还会提高它们的稳 定性。因此双水相萃取体系正越来越多地被用于生物技术领域。1这两个亲水成分的非互溶性，可用它们各自分子结构上的不同所产生的相互排斥来 说明，葡聚糖本质上是一种几乎

8、不能形成偶极现象的球形分子。而PEG是一种具有共享电 子对的高密度直链聚合物。各个聚合物分子，都倾向于在其周围有相同形状、大小和极性分 子，同时，由于不同类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物 发生分离，形成二个不同的相，这就是所谓的聚合物不相溶性。2某些水溶液聚合物呈现出与此不同的性能，当混合时，水分被大量地排出，两聚合 物表现为强烈的相互吸引力，在这种情况下，聚合物离开基本上像纯溶剂的第二液相而聚集 在单一的相中，这一过程称为复杂的凝聚。在没有强烈的吸力或斥力时可以实现完全的混溶， 但对许多聚合物系统，这种情况应该属于例外。3 某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，

9、只要浓度达到一定范围时，体系也会形 成两相，成相机理目前还不十分清楚，有人认为是盐析作用。二、双水相系统的类型各种双水相系统列于表7-1中。用于生物分离的高聚物体系有聚乙二醇（简称PEG）/葡 聚糖（简称Dextran）和PEG / Dextran硫酸盐体系，高聚物/无机盐体系有PEG /硫酸盐和 PEG/磷酸盐体系。利用生物物质在两相中不同的分配，可以实现它们的分离。高聚物/高聚物体系表7-1中的双水相体系，基本上可分为两大类：甘职痂工八乂痂壬“刁 咼聚物/低分子物质体系（一）高聚物/低分子物质体系PEG/盐体系是最常见的价廉体系。在PEG/盐体系中，一般蛋白质主要分配在下相, 只有疏水性很

10、强的蛋白质或等电点较低的蛋白质，才有可能分配在上相中。这种体系中盐浓 度太高，后续的纯化工艺不能采用有效的层析方法。虽然该体系的成本低，比较适合于工业 规模的应用，但废盐水的处理比较困难，不能直接排入生物氧化池中。（二）高聚物/高聚物体系蛋白质在两相中的分配取决于高聚物分子量、浓度、pH值及盐浓度等因素，细胞的分 配也不固定，这种体系可以直接用离子交换层析进一步纯化，而且可回收高聚物，使成本大大降低。该体系的成本比PEG/盐体系的成本的高出35倍，但不会造成严重的环境污染 并且比较易于生物降解。从以上的对比中，可以看出两种体系各有千秋，应根据具体分离、纯化对象选择不同的 系统。（三）分离某一生

11、物大分子，双水相系统选择原则： 必须有利于目的物的萃取和分离； 兼顾到聚合物的物理性质，如甲基纤维素和聚乙烯醇，因其粘度太高限制了他们的使用 PEG/Dex 以无毒和良好的可调性而得到广泛应用。第二节 双水相萃取过程的理论基础一、相图图7-2 PEG/Dex体系的相图(掠広逼)歩、馳ffiH2双水相系统的相平衡特性可以用类似于传统的溶剂萃取的常规方式来描述。在P130图 7-2中表示了 PEG6000/Dex/水 系统的相图（40C时），图中以聚合物（PEG）的浓度 （m/m） 为纵坐标，以聚合物（Dex）的浓度 （m/m）为横坐标。图中把均匀区与两相区分开的曲线, 称为双节线。如果体系总组成

12、配比取在双节线下面的区域，两高聚物均匀溶于水中而不分相，为一相 区（均相区）。如果体系总组成配比取在双节线上方的区域，体系就会形成两相。Q当它们的组成位于双节线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度， 轻相（或称上相）组成用 T 点表示，重相（或称下相）组成用 B 点表示， T、B 点称为 结点。由图可知，上相主要含PEG，下相主要含Dex。T、M、B 三点在一条直线上，称为系线。在同一系线上不同的点，总组成不同，而上、下两相组成相同只是两相体积V、V不TB同，但它们均服从杠杆原理。当两相达到平衡时（M点为整个系统的组成），符合杠杆规贝1丄（相比=1m）7-1）vBMvM

13、TB式中BMB点到M点的距离VT上相的体积MTM点到T点的距离VB下相的体积当M点下移，系线长度下降，B、T两点接近，两相组成差别减小，到达双节线上C 点时，系线长度为0，两相差别消失，成为一相， C 点成为系统的临界点。Q双节线的位置与形状与聚合物的相对分子质量有关：图7-3Dex相对分子量越高，相分离所需的浓度越低。I两聚合物相对分子质量相差越大，双界线形状越不对称。二、物质在两相中的分配及影响因素 蛋白质等生物大分子物质在双水相中的分配也服从 Nerst 分配定律，即，物质在两 水相中的分配系数 KcB式中 c 、c 分别代表上相、下相中溶质的浓度TBK与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有

14、关，与溶质的浓度无关。一）表面自由能的影响（对任何物质都存在）分配定律虽是经验定律，但也可有热力学原理推导出这一原理溶剂分子或粒子在溶液中的分配，总是选择两相中相互作用最充分或系统能量达到最低的那个相。根据两相平衡时化学位相等的原则，可推出：ln KM九rkTM为物质相对分子量r九-为系统的表面特性系数 k -为波尔兹曼常数T - - 为 温 度显然因大分子物质的M值很大，九的微小改变就会引起分配系数很大的变化。因此, r利用不同的表面性质（表面自由能），可以达到分离大分子物质的目的。（二）表面电荷的影响 如果粒子带有电荷，并在两相中分配不相等时，就会在相间产生电位，称为道南电位 可用下式表示

15、：U - U21RT Kln bz-(Z+ Z -) K7-6)式中 U2、U分别表示相2和相1的电位Z+、Z分别表示一种盐的正、负离子价K 、K 分别表示正、负离子在两相间的分配系数AZ +BZ -F为法拉第常数（J/molK）R为气体常数T为温度当一种盐的正、负离子对两相有不同的亲和力，即K H K 时，就会产生电位差，丛BZ -正、负离子的离子价之和愈大，此电位差就越小。电位差的变化，也会对分配系数产生影响。由此可见，两相系统中如有盐的存在，会对大分子在两相中的分配产生较大的影响，这称为盐效应。（三）综合考虑综合以上两种主要影响因素，分配系数可用Gerson提出的下列公式表示：一lgK 二 AAy + P（7-8）从上式可见，分配系数和表面自由能及电位差成指数关系。由于影响分配系数的因素很多， 加上各因素间又互相影响，因此目前尚不能定量地关联分配系数与能独立测定的蛋白质的一 些分子性质之间的关系，最佳条件还得靠实验来得到。此外，影响物质在双水相系统中分配的因素主要有双水相系统的聚合物组成（包括聚合 物类型、浓度、平均分子量），盐类（包括离子的类型和浓度、离子强度、 pH 值），以及体系 的温度、微生物等。