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1、ESR1 IVS1 - 401位点rSNP的鉴定及其在慢性HBV相关肝病中的意义晏泽辉 邓国宏 谭文婷 但芸婕 陈文 汤影子 周霞 王小红 毛青 王宇明*第三军医大学西南医院全军感染病研究所 400038 重庆*通讯 王宇明教授, Email： , ：023-68754858背景：我们前期在群体水平和流行病学角度证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及慢性HBV感染相关肝病存在显著遗传关联，且T29C杂合子个体的ESR1 mRNA转录本中，两种等位的表达存在差异。但阳性关联的T29C位点为同义SNP位点，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控
2、区SNPrSNP位点，连锁不平衡分析和生物信息提示，ESR1内含子1IVS1 T-401位点与外显子1 T29C强烈连锁且存在核蛋白结合位点。鉴定此ESR1IVS1 T-401位点rSNP的功能，对揭示ESR1基因多态性在慢性HBV感染相关肝病中的作用具有积极意义。方法：在我们收集的359名HBV感染相关急性肝衰竭(HBV-ALF)患者，464名HBV感染相关肝硬化(HBV-LC)患者和469例HBV感染无病症携带者(ASC)组成的基于医院的病例-对照人群中，采用限制性片断长度多态性 (PCR-RFLP)和直接测序法对ESR1位点基因3个SNPIVS1 T-401/C, T29C, A1194
3、0G进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。综合采用荧光素酶报告基因试验、电泳移动漂移分析EMSA、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术HaploChIP、位点特异性小RNA干扰SiRNA等手实验对阳性关联的ESR1 IVS1 -401T/C位点进行功能验证。结果：HBV感染相关ALF患者病例组和HBV感染相关LC患者病例组中IVS1 -401/C和29C的等位频率显著高于HBV感染无病症携带者疾病对照组 (HBV-ALF vs ASC：P = 3.710-4，HBV-LC vs ASC：P = 2.110-5)。经非条件逻辑回归校正年龄、性别等因素后，在显性模式下，IVS1 T-4
4、01/C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化显著关联。和IVS1 -401T/C或T/T基因型个体相比，IVS1 -401C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭以及HBV相关肝硬化易感性显著升高(显性模式；HBV-ALF vs ASC：OR = 1.79, 95% CI = 1.54-2.12, P = 0.000；HBV-LC vs ASC：OR = 2.07, 95% CI = 1.47-2.92, P = 0.000) 。功能实验在多个角度证实了与T29C位点连锁的IVS1 T-401C位点的可以通过结合核蛋白C-myb而发挥对ESR1表达的顺式调控作用；
5、并且IVS1 T-401C位点的两个等位对核蛋白C-myb的结合能力存在差异，-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强，表现出更强的增强子活性。结论：中国人群中，ESR1 基因多态性IVS1 T-401/C和T29C两个SNP与慢性HBV感染者发生急性肝衰竭和关肝硬化的遗传易感性相关。IVS1 -401C等位可能通过影响了ESR1表达mRNA和蛋白水平而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。前言慢性HBV感染是遗传与环境因素相互作用的复杂疾病。近年来普遍认为宿主因素，尤其是宿主的遗传因素，在慢性HBV感染极其相关肝病的发病机制中起着极为关键的作用2，影响HBV感染和疾病进程的许多
6、阶段3。探讨慢性HBV感染相关肝病的宿主遗传特征，将为我们从另一角度认识慢性HBV感染相关肝病及发病机制提供新的线索，并为临床防治提供新的、合理的策略，而以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究，是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的主要策略。ESR1在慢性HBV感染相关肝病的发生、开展及生存预后中均有重要作用，但其转录和表达存在显著的个体差异。顺式调控位点等位变异的功能影响是当前人类基因组研究的重要内容。本课题组前期研究从群体水平和流行病学角度已经证实了ESR1基因外显子1 T29C多态性与慢性HBV感染及HBV感染相关肝细胞癌的遗传关联。并且发现T29C杂合子个体的ESR1 m
7、RNA转录本中，两种等位的表达存在差异，C等位的表达量显著高于T等位。但T29C位点为同义SNP位点(Ser/Ser)，其本身不具有功能意义。可能存在与外显子1 T29C位点连锁不平衡的调控区SNP(rSNP)位点。初步分析和前期实验提示与T29C高度连锁的内含子1 IVS1 -401T/C SNP位点是最可能影响转录调控的功能位点。鉴定IVS1 -401位点的顺式调控作用，观察C/T等位变异对ESR1启动子使用以及mRNA外显子缺失变异体产生的影响，对认识肝组织中ESR1表达调控个体差异的内在机制具有重要意义。本研究拟采用EMSA、荧光素酶报告基因试验(DLRA)、等位特异性染色质免疫沉淀(
8、HaploChIP)、位点特异性RNA干扰(SiRNA)等手段，证实IVS1 -401位点的等位特异性顺式调控作用，以期深入认识ESR1基因rSNP在慢性HBV感染疾病进程中的功能和作用。研究对象，材料和方法：略主要结果：一、ESR1基因SNPs与HBV相关肝病的关联分析(一)研究对象的临床的人口学资料前期建立的慢性HBV感染肝病标本数据库中无亲缘关系的359名的HBV相关肝衰竭患者(HBV-ALF)、470名HBV相关肝硬化(HBV-LC)和469名无病症慢性HBV携带者(ASC)纳入本局部的研究。研究所用样本的简要社会人口学和临床资料见表2-1。在我们收集的基于医院收集的病例-对照队列中，
9、ASC对照组的男性比例(54.2%)显著低于HBV-LC组(83.0%; 2=100.6; P =0.000)和HBV-ALF组(84.4%; 2=76.1; P =0.000)；饮酒指数上ASC对照组与HBV-LC组(2=45.8; P =0.000)以及HBV-ALF组(2=28.9; P =0.000)差异显著，这可能与两组之间在性别分布上差异显著有关，因为在中国饮酒主要以男性为主；ASC对照组的年龄也显著低于HBV-ALF组(37.412.1 vs 41.0 12.6; P = 0.000)和HBV-LC组(37.412.1 vs 43.011.82; P =0.000)；HBeAg
10、阳性率在ASC组与HBV-LC组(2=0.375; P =0.541)以及HBV-ALF组(2=1.819; P =0.177)均无明显差异。表2-7病例对照人群的社会人口学和临床资料CharacteristicAsCHBV-LCHBV-ALF(n =469)(n =468)(n = 359)Gender, no. (%)Men254 (54.2)395 (84.4)298 (83.0)Women215 (45.8)73 (15.6)61(17.0)Age (years), mean (SD)37.412.143.311.841.1 12.7Alcohol drinkers, no. (%)
11、82 (17.5)174(37.2)121 (33.7)HBsAgAll +All +All +Anti-HBs IgGAll -All -All -HBeAg positive, no (%)120(25.6)128(27.3)107(29.8)Anti-HBc IgGAll +All +All +TBil ( mol / L )13.5 4.3205.2 193.4321.1 166.1ALT ( IU / L )27.7 10.8284.0 426410.1 541.6注：“Drinker定义为男性每周饮白酒40 g/week 或女性男性每周饮白酒20 g/week； AsC,无病症携带
12、者；HBV-LC，HBV相关肝硬化；HBV-ALF，HBV相关急性肝衰竭患者 (二)病例及对照标本的ESR1 SNPs分型 采用PCR-RFLP对对所有样本IL-10基因的3个SNP位点进行分型。其中随即选取5%的样本进行直接测序以验证PCR-RFLP方法分型的准确性，结果与测序结果完全吻合(图2-1至图2-5)。图2-6 IVS1 T-401C位点PCR- Pvu II-RFLP分图2-7 T29C位点的PCR- BamH I-RFLP分型图2-8 ESR1 A11940G位点的PCR- Alw26 I-RFLP分型图2-9 ESR1 IVS1-401T/C位点测序验证(三) ESR1基因3
13、个SNP位点与HBV相关肝病的关联分析1. 分型结果的初步分析ESR1基因3个SNP位点在病例对照人群中分型结果显示(见表2-9)：ESR1 A11940G位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC对照组和HBV相关ALF病例组(2=0.357; P =0.550)以及HBV相关LC病例组(2=1.439; P =0.230)之间均无明显差异；但是ESR1 IVS1 T-401C位点的基因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=5.04; P =0.0246)以及HBV相关LC病例组(2=13.06; P =3.010-4)之间均差异显著；ESR1 T29C位点的基
14、因型和等位频率在HBV感染ASC疾病对照组和HBV相关ALF病例组(2=7.22; P =0.0071)以及HBV相关LC病例组(2=20.69; P =5.410-6)之间均存在显著差异；HBV相关ALF组和LC组中-401C和29C 的等位频率显著高于HBV感染ASC对照组。与未携带有- T-401C和29C等位的个体相比，携带有-401C和29C等位的个体显著的增加了HBV相关ALF和LC易感性。表2-9 病例组和对照组ESR1基因型和等位基频率分布及差异显著性Genotype/alleleAsCHBV-ALFHBV-LC(n = 469)(n =359)(n = 464)pvuII s
15、iteT/T, no. (%)166 (35.4)109(30.4)120 (25.9)T/C, no. (%)242 (51.6)182(50.7)251 (54.1)C/C, no. (%)61 (13.0)68(18.9)93 (20.0)T allele, no. (%)574(61.2)400 (55.7)491 (52.9)C allele, no. (%)364 (38.8)318 (44.3)437 (47.1)P Value 0.02463.010-4T29C6.9T/T, no. (%)228 (48.6)143 (39.8)158 (34.1T/C, no. (%)188 (39.7)160 (44.7)225(48.5)C/C, no. (%)55 (11.7)56 (15.6)91 (17.4)T allele, no. (%)642 (68.4)446 (62.1)541 (58.3)C allele, no. (%)296 (31.6)272 (37.9)387
