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1、微生物的生理生化试验 微生物常规生理生化试验摘要 利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌进行淀粉和油脂试验，证实不一样微生物对多种有机大分子的水解能力的不一样，从而说明不一样微生物有着不一样的酶系统，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法；使用大肠杆菌和一般变形杆菌进行葡萄糖和乳糖发酵试验，了解糖发酵的原理和在肠道细菌判定中的主要作用，掌握经过糖发酵判别不一样微生物的方法；利用大肠杆菌、产气肠杆菌进行吲哚试验和甲基红试验，了解两个试验的反应原理和在肠道细菌判定中的意义和方法。 关键词 生理生化 大分子试验 糖发酵试验 吲哚试验 甲基红试验 序言 微生物代谢和其它生物代谢有着
2、很多相同之处，也有不一样之处。微生物代谢主要特征之一，就是代谢类型的多样性，所以使得微生物在自然界的物质循环中起着主要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会和路径。大家在微生物的分类判定工作中，常利用其生理生化反应作用作为主要依据。微生物对大分子淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必需靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶关键为水解酶，经过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内，这些过程均能够经过观察细菌菌落周围的物质改变来证实。 糖发酵试验是常见的判别微生物的生化反应，在肠道细菌的判定上尤为主要。绝大多数细菌全部能利用糖类作为碳源和能源，不过它们在
3、分解糖类物质的能力上有很大的差异。不一样的细菌含有发酵不一样糖的酶，因此发酵糖的能力各不相同，其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。IMViC试验是吲哚、甲基红、伏-普和柠檬酸盐4个试验的缩写，这4个试验关键是用来快速判别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌检验。1、材料和方法材料菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、一般变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。试剂固体油脂培养基3个、固体淀粉培养基2个、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管各3支、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、革兰氏染色用卢戈氏碘染液、甲基红指示剂、乙醚和吲哚试剂等仪器和其它用具无菌平皿、无菌试管
4、、接种环、试管架等方法淀粉水解试验将淀粉培养基溶化后，冷至50左右，以无菌操作制成平板。将制成的平板用记号笔划成四部分，将、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌分别在不一样部位无菌操作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。将上述已接种的平板倒置于37温室中培养48小时。将已培养48小时的平皿取出，打开皿盖，滴加少许卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。油脂水解试验将溶化的油脂培养基冷至50左右时，充足振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平皿中，待凝。将制成的平板用记号笔划成四部分，分别以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌作为试验菌，均用无菌操
5、作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。将接种的平板倒置于37温室中培养48小时。取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。葡萄糖发酵试验和乳糖发酵试验用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接种标识变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，一样分别接入变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，预防倒置的小试管进入气泡。将接种过和作为对照的6支试管置于37恒温培养箱培养48h。观察各试管颜色改变和德汉氏小管中有没有气泡吲哚试验和甲基红试验将大
6、肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基、2支葡萄糖蛋白胨水培养基。将接种过的4支试管置37恒温培养箱培养48h。吲哚试验：培养2d后的蛋白胨水培养物内加34滴乙醚，摇动数次，静至1min，待乙醚上升后，沿管壁渐渐滴加2滴吲哚试剂，产生红色环状物者为阳性反应。甲基红试验：培养2d后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者为阴性2、结果和分析结果四种细菌淀粉及油脂水解试验结果见表-1：附：“+”表示阳性，“-”表示阴性。 葡萄糖发酵及乳糖发酵结果见表-2：表-2葡萄糖及乳糖发酵试验结果统计附：“+”表示产酸或产气，“-”表示不产酸或不产气。吲哚试验及甲基红试验
7、结果见表-3：附：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。试验现象见图1-6：图1 淀粉培养基 图2 油脂培养基图3葡萄糖培养基试管 图4乳糖培养基试管 图5蛋白胨水试管 图6葡蛋水培养基试管分析大分子物质水解试验：淀粉遇碘会产生蓝色，但假如细菌能分泌胞外淀粉酶将胞外淀粉分解、吸收利用，用碘测定不再产生蓝色，在菌苔周围会出现无色透明圈，依据透明圈的大小还能初步判定该菌水解淀粉能力强弱。试验中，只有枯草芽孢杆菌周围出现透明圈，说明在淀粉水解反应中，枯草芽孢杆菌呈阳性，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌呈阴性。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养
8、基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶，试验中，只有铜绿假单胞菌周围出现红色斑点，说明铜绿假单胞菌的脂肪水解为阳性反应，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为阴性反应。糖发酵试验：有的细菌分解某种糖会产生某种有机酸和气体，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色，气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有没有气泡来证实。试验中，葡萄糖培养基试管中，接种大肠杆菌和变形杆菌的试管内出现气泡且培养基变为黄色，对照组无气泡，培养基仍为紫色；乳糖培养基试管中，接种大肠杆菌的试管内产生气体且变为黄色，接种变形杆菌的试管内无气体且仍为紫色，说明大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖产酸产气，一般变形杆菌分解葡萄糖产酸
9、产气，不能分解乳糖。IMViC试验：吲哚试验可用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚和对二甲基苯甲醛结合形成红色的玫瑰吲哚，但并非全部的微生物全部含有分解色氨酸产生吲哚的能力。试验中，接种大肠杆菌的蛋白质水培养基内，乙醚和培养物之间产生了红色环状物，为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。甲基红试验用来检测由葡萄糖产生的有机酸，当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色变为红色，即甲基红反应。试验中，只有接种大肠杆菌的葡萄糖蛋白胨水培养基变红色，所以，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。3、小结此次试验是三个生理生化反应同时
10、做的，即使试验中六种培养基是六个组分别做的，我们没有亲自体验每一个培养基的制作过程，但从接种到观察的一系列步骤全部是每个小组独立完成的，从试验结果来看，试验还算比较成功，从试验中我们了解了生理生化反应的基础原理，也体会到了其在微生物判别中的主要性。试验中，我们采取了设计空白对照组的方法，以后的试验中还会常常用到。在吲哚试验中，因为我们试验组同学的失误，把产气肠杆菌接成了变形杆菌，所以，我们只观察大肠杆菌培养基的红色环，没有观察产气肠杆菌有没有红色环产生，只能借其它同学的产气肠杆菌观察。在以后的试验中，一定要看清试验要求，接种前，要把该标识的标识好，一定要清菌种再接种。试验部分影响试验成功是否的细节必需注意，在大分子试验中，4种菌接到了一个培养皿中，做好记号十分主要；糖发酵试验中，在接种后，应轻轻摇动试管使其均匀，预防倒置的小管进入气泡，避免造成假象，得犯错误结果；吲哚试验中，要注意加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁渐渐加入2滴吲哚试剂，只有这么才能出现红色环状物；在甲基红试验中，注意甲基红不要过量，以免出现假阳性。4、
