兽医免疫学实习指导

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1、实验一 免疫学基础实验 动物试验目的 掌握实验动物的接种、采血及解剖方法和注意事项。 掌握血清的方法。原理 在微生物实验研究工作中,动物实验也是常用的技术之一。其主要用途有：1. 病原体的分离鉴定 有些直接分离培养有困难的病料或需鉴定的 细菌通过易感动物体就可达到目的。2. 确定病原体的致病力 有些细菌的形态、生物学方面性状相似。 仅在致病力上不同，可利用动物实验鉴别3. 恢复或增强细菌的毒力 多数病原菌长期经过人工保存后，其毒 力减弱，需通过易感动物保持原来的致病力4. 测定某些细菌的外毒素 如魏氏梭菌的毒素测定5. 制备疫苗或诊断用抗原 如兔化猪瘟疫苗6. 制备作诊断或治疗用的免疫血清 如

2、作鉴定用的沙门氏菌诊断血 清7. 用于检验药物的治疗效果及毒性等实验材料1. 接种材料大肠杆菌的肉汤培养物2. 实验动物家兔，小白鼠3.其他物品 注射器（1mL、 10mL）,针头（4#、5#、6#、16#）,酒精 棉，镊子，解剖板，剪刀，手术刀等。实验内容1. 接种（1）皮下接种（注射）a.家兔由助手把家兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧皮下结缔组织疏松部位剪毛消毒，术者右手持注射器，以左手拇指、食 指和中指捏起皮肤呈一个三角皱摺于其底部进针。注射时针头斜面 朝上,斜刺入皮下，感到针头可随意拨动即表示插入皮下，缓缓注入接种物0.1-0.2mL,当推入注射物时感到流利通畅也表示在皮下。拔出针头后

3、用酒精棉球按住针孔并稍加按摩。b.小鼠 无须助手保定。术者在做好接种准备后，先用右手抓住 鼠尾，令其前爪抓住饲料罐的铁丝盖，然后用左手的拇指及食指捏住 颈部皮肤，并翻转后使小鼠腹部朝上，将其尾巴夹在手掌与小指之间， 右手消毒术部，把持注射器，以针头稍微挑起皮肤插入皮下，注入时 见有水泡微微鼓起即表示注入。(2) 皮内接种方法同(1 )。接种者以左手拇指及食指夹起皮肤，右手持注射器， 用针头插入拇指及食指之间的皮肤内，针头插入不宜过深，同时插 入角度要小，注入时感到有阻力且注射完毕后皮肤上有硬泡即为注 入皮肤。皮内接种要慢，以防止皮肤胀裂或自针头流出注射物而散 播传染。针头平行刺入皮肤真皮内，挑

4、起，注入接种物。注射时有 明显的阻力，注射后局部出现一个小水泡。(3) 腹腔接种小鼠腹腔接种-接种时稍抬高后躯，使其内脏倾向前腔，在股 后侧面插入针头，先刺入皮肤，后进入腹腔，注射时应无阻力有落空 的感觉，皮肤也无泡隆起。(4) 肌肉注射注射部位选择后肢股部。术部消毒后，将针头刺入肌肉内，注射感 染材料。(5) 静脉注射a. 家兔 耳静脉 将家兔保定，选一侧耳边缘静脉，先用 70%的 酒精涂擦兔耳或以手轻弹耳朵，使静脉怒张。注射时，用左手拇指和 食指拉紧兔耳，右手持注射器，使针头与静脉平行，向心脏方向刺入 静脉内，注射时无阻力且有血向前流动即表示注入。注射完毕后用酒 精棉球紧压针孔，以免流血和

5、注射物溢出。b. 小白鼠 注射部位选择尾静脉。选15-20g体重的小鼠，注射 前将尾部浸于温水中1-2分或酒精棉球涂擦，使尾部血管扩张易于注 射。用一烧杯扣住小鼠，露出尾部，用最小的针头刺入尾静脉，缓缓 注入注射物，注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起则表示注入。2. 采血家兔心脏采血将家兔仰卧保定。术者在左前肢腋下处局部剪毛消毒，在胸部心跳 最明显处下针，直刺心脏，感到针头跳动或有血液向针管内流动时即 可抽血。3. 解剖小白鼠剖解 处死小鼠后,将小鼠固定在解剖板上,消毒剪刀镊子，局部消毒皮肤 后，依次打开皮肤腹膜肌肉，观察各脏器的形态。实验报告简述各项操作方法的过程及其注意事项。思考题1. 实验

6、动物在微生物学实验中有何重要意义？2. 在实验中为何要严格无菌操作？实验二 抗原的制备目的掌握抗原的制备过程。原理要制备优质免疫血清，抗原的质量是先决条件。抗原的免疫原性 除与其分子量的大小有关外，还与其表面抗原决定簇的性质、位置 立体构型有密切的关系。一种抗原成分可刺激机体产生一种抗体，因 此在免疫动物前应纯化抗原，抗原的用量也应根据抗原的性质、免疫 动物的种类和需要的抗体的特性决定。一般认为，采用多次小剂量、 逐步递增法注射。实验材料1. 接种材料 羊血清；细菌培养物2. 实验动物 家兔3. 其他物品 注射器、量筒、烧杯、吸管、滴管、酒精棉，镊子，剪刀，手术刀等。4. 试剂 硫酸铝钾、0.

7、01%硫柳汞生理盐水、蒸馏水等 实验内容1.血清抗原的制备（将血液置37C温箱1h,再置4C冰箱内3-4h或过夜。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清，以3000rpm,15min 取上清）血清 5/25mL 蒸馏水 16/80mL100g/L 的钾明矾（硫酸铝钾）水溶液18/90 mL混合-用 5mol/L 的 NaOH 滴定 PH 约 6.5-离心，去上清液用 0.1g/L 的硫柳汞生理盐水离心洗涤 2 次沉淀物加 0.1g/L 的硫柳汞 生理盐水至50/100mL4C保存。2. 全菌抗原的制备斜面培养物 生理盐水洗下，确定其浓度为10亿/ mL一沸水浴2h加0.3-0.5%甲醛处理，

8、4C保存。实验三 免疫血清的制备及纯化目的掌握免疫血清的制备过程及纯化方法。原理免疫血清是免疫学实验必不可少的生物制剂，免疫血清的质量直接 影响实验的准确性、特异性和敏感性。将具有抗原性的物质免疫动物 可刺激动物机体产生特异性的抗体。因此，根据抗原的性质选择合适 的动物制定合理的免疫方案，制备优良的血清。从血清中分离免疫球 蛋白与其他血清蛋白的分子大小、电离密度、等电点及在水溶液中的 溶解度不同的特性，将它们分离出来，进而加以纯化。方法常用的有： 盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法和亲和层析法等。实验材料1. 抗原2. 实验动物 家兔3. 其他物品 注射器 、生理盐水、饱和硫酸铵溶液、灭菌毛细

9、滴管、PBS、纳氏试剂、氯化钡等实验内容1. 免疫动物血清抗原： 2mL/kg 多点（颈后皮下、两后肢大腿外侧肌注）免疫家兔，7d后再注射一次（二免）。全菌抗原：以0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0mL间隔4d将加热菌 家兔静脉注射4次（第1d,第5d,第9d,第13d）。2. 免疫血清的分离及保存血清抗原：二免 7d 后采血分离血清 -加 0.1g/L 的硫柳汞或 0.2g/L叠氮钠防腐-一4C保存。全菌抗原：最后一次注射 7d 后采血，分离血清加等量甘油防腐， 4C保存备用。3. 免疫血清的纯化-盐析法xmL血清+xmL等量生理盐水，于搅拌下逐滴加2xmL饱和硫酸铵 溶液（终

10、浓度为 50） 4 C， 30min 使其充分沉淀 离心（3000rpm）,30min,弃上清（白蛋白）-一沉淀（球蛋白）溶于少量生 理盐水中，加生理盐水恢复至 2xmL -搅拌滴加 xmL 饱和硫酸铵溶 液（此时（NH4） 2SO4的饱和度为33%）-一 4C静置30min -一离心 （3000rpm）,30min, 弃上清（假球蛋白部分） -重复上述操作 1-2 次 至上清液无色即可将末次离心后所得沉淀物溶于少量生理盐水中,用毛细滴管将其移入透析袋中,两端扎紧,留出1/10 的空隙, 将透析袋浸于大烧杯中-用 PH7.4 PBS 充分透析、除盐换液 3 次, 至萘氏试剂测透析外液为无黄色-

11、一收集IgG, 4C保存备用。实验四 免疫细胞的分离及观察酯酶染色目的 掌握免疫细胞的分离技术及免疫活性细胞的识别方法。原理T细胞细胞浆内含有酸性a-醋酸萘酯酶（ANAE）,在弱酸性条件下， 能使底物a -醋酸萘酯水解成醋酸和a -萘酚，后者与六偶氮付品红偶 联生成红色不溶性的沉淀物.沉积在 T 淋巴细胞胞浆内酯酶所在的部 位,经甲基绿复染,反应颗粒颜色变暗,呈紫红色（棕红色） .而 B 淋巴 细胞胞浆内不含ANAE，故ANAE染色呈阴性。可进行T、B细胞的识别， 是一种非特异方法。实验材料1. 血推片2.试剂 2.5%戊二醛固定液、染色液、4%亚硝酸钠溶液、2%a- 醋酸萘酯溶液、PBS、甲

12、基绿染液等实验内容血推片-一干燥一-立即4C（亦可室温）固定10min-一滤纸吸干-一 孵育液37C 1h水洗 甩干 甲基绿染色2min 水洗 吸干、 镜检、计数。结果：凡细胞浆内有 1-2 个或多个紫红色颗粒，胞浆呈淡绿色， 胞核为较深绿色的淋巴细胞为T细胞，未见颗粒者为B细胞。实验五 凝集试验 目的 1. 熟悉玻板凝集试验和试管凝集试验的操作技术。2. 掌握凝集反应结果的判定方法。原理 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应的抗体结合后，在有电解质存 在时，抗原颗粒互相凝集成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。 其机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基,极性基 的相互吸附使抗原外周的水化膜

13、去除,由亲水溶胶变为憎水溶胶。由 于电解质具有降低点位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而 产生凝集现象。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。就免疫球蛋白的性质来说，主要为IgM和IgG。凝集试验又分为直 接凝集试验和间接凝集试验两种，前者主要用于新分离细菌的鉴定 或分型，后者可用于可溶性抗原抗体系统的检测。实验材料 布氏杆菌试管凝集抗原、布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准 阳性血清、布氏杆菌标准阴性血清、牛布氏杆菌病待检血清、生理 盐水、玻板、试管、 0.2mL 吸管或微量加样器。 0.5石炭酸生理盐 水、生理盐水、接种环、酒精灯等。实验内容1 布氏杆菌平板（玻板）凝集试验取洁净

14、玻板一块，用标记笔划成方格，每格分别加被检血清O.OImL、0.02mL、0.04mL、0.08mL，再加布氏杆菌平板凝集抗原各0.03mL 于方格内，从血清量最低的一格开始用一根火柴棒或牙签混 合均匀。同时设阴、阳性血清对照。混匀完毕后，将玻板置室温（20C） 410min内记录反应结果。结果判定 在阳性血清和阴性血清试验结果正确的对照下判定结 果，用“十”表示反应的强度。+：液体完全透明，菌体完全被凝集呈现大的凝集块，呈片状、 块状或颗粒状（即100的菌体被凝集）。+： 液体略呈混浊，菌体大部分被凝集。 （75菌体被凝集）。 +： 液体不甚透明，菌体部分被凝集。 （50菌体被凝集）。+：

15、液体透明度不明显或不透明，有不甚显著的凝集块。 （25 菌体被凝集）。-： 液体不透明,无凝集。2牛布氏杆菌试管凝集试验加样 每份血清用试管4支，另取对照试管3支，置试管架上。如 待检血清有多份，对照只需1 份。按表先加 0.5石炭酸生理盐水， 然后以1mL吸管或加样器吸取待检血清0.2mL,加入第1管中，充 分混匀，吸出1.5mL弃之，再吸出0.5mL加入第2管，混匀后加入 第3管，依此类推至第4管，混匀后弃去0.5mL。第5管中不加待 检血清，第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5mL，第7 管中加入1： 25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5mL。加抗原 每管各加入以 0.5石炭酸生理盐水稀释20 倍的布氏杆菌 试管凝集抗原 0.5mL。作用 在各试管加完抗原后，将7支试管同时充分混匀，置37C培 养箱中410h,取出后置室温1824h，然后观察并记录结果。待 检血清稀释度：猪、羊、狗为1:25， 1:50， 1:100， 1:200；牛、 马和骆驼为 1:50， l:100， 1:00， 1:400 等四