细胞凋亡的检测方法

《细胞凋亡的检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞凋亡的检测方法（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE （苏木精一伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆 形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现 象。（2）丫啶橙（A0）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光， 胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见 细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞, 细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为 正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞 有一定的帮助。（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、 边集，常

2、呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或 出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。2、DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA 片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180 200bpDNA片断，而 坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群 体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核

3、小体。核小体由组蛋白及其伴 随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合4、加酶的底物，测光吸收制。用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小 鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确 测定凋亡细胞发生的绝多对量。3、流式细胞仪定量分析细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细 胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色

4、， 利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死 细胞核凋亡细胞。应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2）、可以做许多相关性分析3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细 胞周期（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞 和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利 用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细 胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅

5、， 凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要 摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。（2）DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持 不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP） 和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3的羟基（-OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术，它是利 用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3-OH端2、原位缺口末端标记技术（in sit

6、u end labelling technique,ISEL）， 即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3-OH端。研究证明， TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为 合适。（3）检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至 细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂 结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为 探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和 力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如

7、异硫氰酸荧光素 FITC）,同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外 测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋 亡细胞。结果判断：正常活细胞Annexin V、PI均低染；凋亡细胞Annexin V 高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因 此 AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片 过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结

8、果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞 凋亡的方法。方法及步骤A.直接标记抗体（FITC标记抗体）： 收集1X106个细胞，800rpm离心5min, 4C以上冷PBS洗一次。(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,00rpm离心5min去上清。 加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。(3) 用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10min,800rpm 离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗 体(5 X 105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上 清。加入200ul 1%多聚甲醛固定，待测即可。(4

9、) 用流式细胞仪检测荧光值，每管计数10 000个细胞。B.未标记抗体间接免疫荧光标记法：(1) 收集2X106个细胞，用冷的PBS 2ml洗涤细胞一次，800rpm 离心5min。(2) 用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min； 2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；(3) 用1ml含0.2%Tri ton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放 置 10min,800rpm 离心 5min。(4) 加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min， 用2ml冷的PBS重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重

10、复一次。(5) 加入荧光标记(FITC)标记的二抗，冰上避光放置40min后， 800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。(6) 加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。(7) 流式细胞仪检测荧光值，每管计数10 000个细胞。C细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。（2）用4C预冷的70%冷乙醇固定，4C保存，至少固定18小时。（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗 三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37C孵育30分钟即可进行流式 分析。（4）PI染液终浓度为50微克

11、/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫 升。培养细胞染色体显示法（1 ）传代培养细胞染色体显示法培养细胞一加秋水仙素一采集分裂细胞一离心一低渗处理一预固定固定一重复固定一制片一染色和封片1. 培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%90% 汇合单层培养细胞。2. 加秋水仙素：使用最终浓度为0.020.8微克/毫升营养液，温箱 继续培养610小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于4C条件 下612小时后，再于37C温箱继续培养610小时处理（加秋水 仙素）。3. 采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点， 此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面

12、 反复冲刷。应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿 用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。4. 离心：收集培养液，1000转/分钟离心510分钟。5. 低渗处理：吸除上清液、加入预温至37C的0.075M KCI溶液， 在温箱中静置2030分钟。6预固定：向悬液中加新鲜1: 3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹 打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘 连成块。7固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂510ml ；加固定 剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴 滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置 1520分钟。

13、8. 重复7,末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度 大小，余下固定液0.51ml。9. 制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何 油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在 载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴23滴细胞悬液， 滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥， 或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进 行染色观察。10. 染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8 磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。 如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲

14、苯两次后，用中性树胶封 片后，再过二甲苯，然后封片亦可。(2) 人末梢血微量全血培养染色体显示法1 培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液(pH7.2)，内含：1640培养液(含10%15%小牛血清)，PHA 0.1ml， 青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液2. 抽血针管准备：取25ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无 菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素(100U/ml BBS)少许湿润针 管，如动作迅速不用肝素亦可。3. 采血：用棉签75%酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血 带，静脉取血12ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4 0.5ml，如

15、系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件 略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不 应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。4. 培养和加秋水仙素：37C温箱中培养到6072小时之间，此时细 胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.020.08微 克/毫升营养液，再培养46小时。5. 低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075MKCI溶液10ml，置温箱中低渗处理1520分钟。6. 其余步骤与处理传代细胞法相同。(3) 羊水细胞培养1抽取羊水：无菌抽取羊水10-20ml，立即注入无菌离心管2离心分离：1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml.3培养：加培养液4ml (含小牛血清1ml),用NaHC03调PH至6.8, 置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细 胞生长；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。一般染色体制片程序1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。2、将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培 养基，处理12小时。3、 将细胞培养液倒掉，马上加入3