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1、荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化实验*摘 要 对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基组成进行优化研究,结果表明,荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的最优培养基组成为:柠檬酸钠319 g、NH4Cl 014 g、KH2PO41136 g、酵母膏011 g、无水MgSO4013 g、FeSO49mg、蒸馏水1 000 mL,pH 714。该配方在30e,500 lx光照下,类胡萝卜素的产量为1107 mg/g菌体湿重,较优化前产量的0145 mg/g(菌体湿重)提高了1倍多,而培养基成分减少了6种。关键词 光合细菌,培养基,优化,类胡萝卜素 类胡萝卜素(carotenoids)是四萜类化合物,普遍存在
2、于动物、植物、真菌、藻类和细菌中,含有呈黄色、橙红色或红色的色素。除可预防VA缺乏症外,还具有抗癌、抗心血管病、抗白内障等功能1。目前已被国际权威机构FAO和WHO等国际组织认定为A类营养色素,并在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功能的食品添加剂。近年来,采用微生物发酵提取类胡萝卜素的研究已经有一些报道,比如红酵母、三孢布拉式霉菌、胶质红假单胞菌等。但是对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的研究,国内未见报道。文中以荚膜红假单胞菌为材料,以经典的培养基为基础,研究培养基组成对菌体生长和类胡萝卜素产量的影响,进行培养基优化实验,为光合细菌类胡萝卜素色素研制做基础工作。1 材料与方法111 光合细
3、菌荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulatus),本研究室选育保存菌种。112 光合细菌全成分培养基乙酸钠310 g,NaCl 110 g,(NH4)2SO4013 g,MgSO4012g,CaCl250 mg,酵母膏011 g,MgSO4215 mg,蛋白胨10 mg,KH2PO4015 g,K2HPO4013 g,FeSO45 mg,谷氨酸012 mg,蒸馏水1 000 mL,pH 714。113 主要仪器设备JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、BECKMAN Allegra 64R高速冷冻离心机、岛津UV-1700全波长扫描仪、SP-
4、1105型紫外可见光分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、生化培养箱(广东省医疗器械厂)、ModelJD)3光强测定仪(上海市嘉定学联仪表厂)、奥立龙Model868 pH计。114 光合细菌培养方法将保藏菌种接入液体培养基,在(30?015)e,500 lx下静置培养30h,然后以10%的接种量将菌液移接到装有200mL发酵培养基的三角瓶中,同上述条件培养。实验中采用稳压电源来减少光照强度的波动。115 培养基优化方法以光合细菌全成分培养基为基础,通过固定其他成分,分别改变培养基中的碳源、氮源等形成新的配方,并采用正交设计等方案研究新培养基对菌体生长( OD660 nm)和色素生成(OD484
5、 nm)的影响。116 类胡萝卜素的提取光合细菌发酵液在4 800 r/min下离心15 min,去掉上清液后用生理盐水洗涤菌体并再次离心,反复3次,得湿菌体。湿菌体中加入体积比为8B1的丙酮、甲醇溶液,采用超声波法破碎细胞(破碎功率200 W,时间8 min)。破碎液放置1 h后在9 000 r/min下离心10 min得粗提取液。向其中加入等体积的10%的NaOH-甲醇溶液,混和液在分液漏斗中摇匀并静置皂化23 min,然后继续加入跟粗提取液等体积的石油醚溶剂,振荡并静置1 min后弃去下层溶液,蒸馏水冲洗石油醚层,直至清亮为止,得到纯类胡萝卜素的石油醚溶液。117 类胡萝卜素鉴定硫酸显色
6、反应2:将纯色素的CH3Cl溶液倒入装有浓H2SO4的试管中,在两相交接处观察颜色的变化。118 类胡萝卜素含量计算3类胡萝卜素提取液没有浑浊且在没有其他非类胡萝卜素色素的干扰下,其大致含量可以使用下列公式计算:总胡萝卜素含量(mg)=光密度值(最大吸收峰的波长下的OD值)总体积(mL)稀释倍数10A25002 结果与讨论211 荚膜红假单胞菌类胡萝卜素的提取及鉴定21111 荚膜红假单胞菌菌体生长与色素生成曲线以全成分培养基为基础,测定荚膜红假单胞菌菌体生长(OD660nm)和色素生成(OD484nm)的曲线。结果(图1)表明,菌体生长与色素生成呈同步关系。为此,后续的研究多采用色素OD48
7、4 nm曲线进行探讨。21112 类胡萝卜素的鉴定将提取到色素的石油醚溶液倾入装有浓H2SO4的试管中,两相交接处呈现蓝色,说明有类胡萝卜素存在。212 荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的培养基优化类胡萝卜素发酵是一个复杂的生理生化过程,不同的培养条件(如温度、培养基成分、pH、通气量等)直接影响菌体代谢,从而影响类胡萝卜素产量6。本文仅从培养基方面对荚研究简报2005年第31卷第5期(总第209期)167 图1 菌体生长与色素变化曲线膜红假单胞菌产类胡萝卜素的条件进行优化。21211 单一碳源分别以蔗糖、乳糖、柠檬酸钠、草酸钠代替全成分培养基中的乙酸钠,添加量为013%,研究不同碳源对类胡萝卜素产
8、量(OD484nm)的影响,所得结果见图2。图2 单一碳源对类胡萝卜素产量的影响由图2可以看出,柠檬酸钠做碳源产色素最多,醋酸钠次之,乳糖做色素较低,草酸钠和蔗糖则更差。213 不同氮源对荚膜红假单胞菌生长和类胡萝卜素积累的影响分别以( NH4)2HPO4、NH4H2PO4、谷氨酸、NH4Cl、NH4NO3、蛋白胨代替全成分中的(NH4)2SO4(添加量为0103%)进行实验。从结果(图3)可以看出,(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4和NH4Cl均是荚膜红假单胞菌生长和产色素的较好氮源,但NH4Cl较优于其他2种。图3 不同氮源对荚膜红假单胞菌产类胡萝卜素的影响214 生长因子和无机盐的
9、优化21411 生长因子的优化以全成分培养基为基础,探讨培养基中的谷氨酸、酵母膏、蛋白胨的存在与否对菌体产色素的影响,结果如表1。由实验结果可知,培养基中无谷氨酸、蛋白胨时,色素的产量较高,但培养基中无酵母膏时色素的产量下降。这表明酵母膏是必需的生长因子。表1 生长因子对荚膜红假单胞菌菌体生长和色素生成的影响培养基的生长因子OD484 nm(类胡萝卜素产量)OD660 nm(菌体量)全成分培养基21244 11492全成分培养基去谷氨酸21516 11658全成分培养基去酵母膏21228 11451全成分培养基去蛋白胨21522 1168021412 无机盐的优化在上述研究的基础上,以每升蒸馏
10、水中加入柠檬酸钠310 g、NH4Cl 013 g、酵母膏011 g、NaCl 110 g、MgSO4012 g、CaCl250 mg、MnSO4215 mg、KH2PO4015 g、KH2PO4013 g、FeSO45 mg为配方进行实验,继续优化培养基中无机盐。2141211 NaCl的影响去除上述培养基中NaCl进行实验,结果(表2)表明NaCl对类胡萝卜素产量影响不大。表2 NaCl对类胡萝卜素生成的影响湿重/g#L-1OD484nm有NaCl 4109 11266无NaCl 3173 111522141212 Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+的影响根据文献报道8, Ca2+、M
11、g2+、Fe2+等对光合细菌的菌体生长和色素生成的影响较大,为此,试验中研究了Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+几种离子的量对光合细菌产色素的影响,结果见图4图7。从实验结果可以知道,Ca2+和Mn2+对菌体起到了抑制作用。而Fe2+和Mg2+均存在最适浓度,经过实验初步获得Fe2+为312410-5mol/L、Mg2+为313210-3mol/L,高于或低于此浓度时,类胡萝卜素的生成量都会下降。图4 Fe2+对色素生成的影响2141213 K、P元素以上面优化的培养基,即在每升蒸馏水中加入柠檬酸钠食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES168 200
12、5 Vol.31 No.5 (Total 209)图5 Mg2+对色素生成的影响图6 Mn2+对色素生成的影响图7 Ca2+对色素生成的影响310 g,NH4Cl 013 g,MgSO4014 g,酵母膏011 g,KH2PO4015g,K2HPO4013 g,FeSO49 mg为1号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4为2号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4后加入0168g/L的KH2PO4为3号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4后加入0168 g/L的KH2PO4以及011 g/L的KCl为4号培养基;去掉KH2PO4、K2HPO4后加入0185 g/L的KH2PO4为5号培养基
13、进行实验。结果(表3)表明,培养基中加入0185 g/L的KH2PO4(5号实验)与加入015 g/L的KH2PO4和013 g/L的K2HPO4(1号实验)效果相当。表3 K、P元素对荚膜红假单胞菌菌体生长和色素生成的影响项 目培养基1号2号3号4号5号OD660 nm11342 11248 11252 11216 11346OD484 nm21428 21260 21316 21260 21422最终pH 8155 8175 8147 8152 8162215 正交实验21511 正交实验设计与分析根据单因素实验的结果,设计了3水平4因素的正交分析表9(如表4),实验结果如表5。由表5得最
14、佳培养基为A1B1C1D1,即最佳培养基为:柠檬酸钠319 g,NH4Cl 014 g,MgSO4013 g,酵母膏011 g,KH2PO41136 g,FeSO49 mg,蒸馏水1 000 mL,pH 714。表4 正交实验因素分析表水平因素A(柠檬酸钠)/g B(NH4Cl) /g C(K2HPO4)/g D(MgSO4)/g1 319 014 1136 0132 310 013 0185 0143 211 012 0134 015表5 正交实验方案及结果实验号A(柠檬酸钠)/gB(NH4Cl)/gC(KH2PO4)/gD(MgSO4)/g第1次结果(OD484nm)第2次结果(OD484
15、nm)合计1 1(319) 1(014) 1(1136) 1(013) 31284 31326 616102 1 2(013) 2(0185) 2(014) 31124 31014 611383 1 3(012) 3(0134) 3(015) 21314 21374 416884 2(310) 1 2 3 21590 21734 513245 2 2 3 1 21554 21446 510006 2 3 1 2 21491 21502 419937 3(211) 1 3 2 21258 21274 415328 3 2 1 3 21262 21342 416049 3 3 2 1 21047 11986 41033K1171436 161466 161207 151643K2151317 151742 151495 151663K3131169 131714 141220 1
