TaqMan实时荧光定量RT

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1、TaqMan实时荧光定量 RT-PCF检测ERCC变异剪接体检测平台的建立、尸 、-前言对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。在 TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR技术（TaqMan real-time quantity RT-PCR） 出现前，传统的检测方法有 4 种1, 2：（1）Northern blot; （2）核酶保护分析；（ 3） 相对定量RT-PCR,4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的 RNA 才能检测出来，仅仅适合相对定量分析 3。核酶

2、保护分析比 Northern blot 相对灵 敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的 RNA 才方便检测 4-8。相对定量 RT-PCR 则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析， 由于每个样本的 起始拷贝数不一致， 很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。 而且此方法需 要将 PCR 产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加 了污染的可能性。竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应 的竞争子， 然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例， 不仅仅 耗时而且繁琐， 更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性， 而是是一件 极其艰难的工

3、作10, 11。这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对 mRNA的质量要求 较高，结果不稳定。而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结 果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接 体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几 无污染1, 12-14。本研究拟建立对切除修复交叉互补基因 1即ERCC1（excision repair cross-complementationgroup 1）变异剪接体的 TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR检 测平台，为深入研究 ERCC1 的变异剪接

4、奠定基础 15。TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补 的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5端标记报告基团（如FAM ），在 3 端标记淬灭基团(如 TAMRA )。当探针完整时，报告基团所发射的荧光通 过荧光共振能量传递(FRET)被淬灭基团所吸收，从而不能检测到其荧光。Taq酶则具有 5外切酶活性，在 PCR 的延伸阶段，可以从探针的 5端将报告基团水 解掉，并将整个探针完全水解， 使得报告基团和淬灭基团的原有空间结构被打散， 荧光共振能量传递不复存在，从而可以探测到反应体系中报告基团所发射的荧 光。随着 PCR 循环的增加，荧光也不断的累加

5、，从而反映产物的生成情况 16-18 。 在研究变异剪接时， 只需要将 TaqMan 探针设计在发生了变异剪接的外显子的前 后邻近两个外显子处， 即跨在前一个外显子的末端和后一个外显子的前端， 便可 检测到目的变异剪接体的表达量。 在不同的探针上标记不同的荧光物质， 便可以 在同一个反应体系中同时检测各个变异剪接体的表达量12, 19-21 。变异剪接(alternative splicing)是真核生物中广泛存在的一个现象22-27，可 以调节基因的表达水平 28，增加蛋白质的多样性 29, 30，并对肿瘤的生物学行为 有很大的影响 22, 27, 31-34，和肺癌13、乳腺癌35-37、

6、卵巢癌等的发生发展存在一 定的关系。ERCC1是核酸切除修复系统 NER (nucleotide excision repair)的一个关键基 因，在以铂类为基础的化疗中扮演着重要角色。铂类药物通过与细胞 DNA 形成 加合物(Pt-DNA adducts)从而杀伤肿瘤细胞，NER则可以通过切除加合物并修 复被损伤的DNA，从而降低化疗的效果。研究表明 ERCC1的mRNA表达量与 肿瘤患者的化疗敏感性和生存时间具有一定的相关性 38。ERCC1 基因共 10 个外显子，细胞中存在不同比例的两种形式的剪接体，为含 10个外显子的全长剪接体 mRNA (full length, FL),和缺失第

7、 VHI外显子(长 72bp)，仅含 9 个外显子的变异剪接体 mRNA( alternative splicing, AS)39-41。1 ERCC1 基因结构特征分析 (文章写作不规范， ERCC 1基因结构特征分析 一 节是属于材料方法，还是前言部分？我认为这部分ERCC1在 GenBank的背景，可以放在综述里)根据GenBank数据库提供的信息，ERCC1基因ID为GenelD: 2067,位于19号 染色体长臂，处于19q13.2-q13.3位置。ERCC1 在染色体的位置：chromosome: 19; Locatio n: 19q13.2-q13.3铀硏師胡話创&證LS3*I1

8、CtUEAPBTnSLQGL】2池託*ercci qOfficial Symbol ERCC1 and Name: excisi on repair cross-compleme nting rode nt repair deficie ncy, compleme ntati on group 1 (in cludes overlapp ing an tise nse seque nee) Homo sapie nsOther Aliases: COFS4, UV20Other Desig nati ons: excisi on repair cross-compleme nti ng 1;

9、excisi on repair proteinChromosome: 19; Locati on: 19q13.2-q13.3Anno tati on: Chromosome 19, NC_000019.8 (50604712.50619017, compleme nt)MIM:126380Gen elD: 2067ERCC1是研究比较多的基因，ERCC1在染色体的位置图可以在文章中不列出，而且ERCC1基因的染色体位置，与其外显子剪切无关。基因组全长14306 bp,转录为含有10个外显子的mRNA全长为1101bp,编码氨 基酸的mRNA序列从147开始至1040结束，共计894bp是编

10、码氨基酸的序列， 以ATG作为起始密码子，以TGA作为终止密码子(任何一个蛋白质都是与 ATG 为起始密码子，以TGA作为终止密码子，这句多余)。产物ERCC1蛋白含297 个氨基酸。编码核酸序列占基因组核酸的 6.25%。每个外显子的长度在100bp左 右，最长外显子是第Ill外显子，长216bp最短外显子是第IX外显子，长69bp， 平均外显子长度是110bpoExon inform已Imnqth: 1101 bpj number of exons 10NP_C01974.1 length; 297 aa, number of exons: 9EONCoding EONINTRONcoor

11、dlength!-angthcoordslength1 - 139139 bp140 - 53S、半9 bp539 - 650112 bp54& - 650105 bp651 - 25261B76 bp2527 - 27斗2216 bp2527- 了斗2216 bp冇斗3 - 3492750 bp3493 - .3596104 bp3斗93 -：-3596IO斗 bp3597 -斗7221126 bp4723 - 4822100 bp4B22100 bp4B23 -70222200 bp7023 - 709977 bp：70-：- 709977 bp7100 - S959I860 bpS960

12、 - 9059130 bpB960 A 9059100 bp9050 - 9SS5S26 bp9BB6 - 995772 bp9BS6 姿 9957.72 bp995B - 10174217 bp10175 - 1024369 bp10175 - 1024369 bp10244 - 14194、半El bp14195 - 14306112 bp14195 - 1斗2斗551 bpERCC基因内含子与外显子的序列Exo ns and In tron of ERCC1 Gene成熟的全长ERCC1 mRNA含有10个外显子，全长1101bp,从1至146bp是3 非编码区 3UTR (3 untr

13、anslated region，从 1041 到 1101 是 5非编码区 5UTR (5 untran slated regi on)1-1468147ATG849-920 1040TGA1041-1101-5UTRCDS 3 UTR fERCC基因mRN的结构分析The structure of ERCC1 mRNA使用BLAST在人基因组和转录子库里面比对 ERCC1的mRNA序列，可以发现 ERCC1的mRNA序列是非常特异的。（在人基因组和转录子库里比对，应用的 是贪婪比对法则，而且只与人的基因组比对，当然只有ERCC1可比对，这些与外显子检测无关，可删除）=200111 11102

14、004006008001000Color key for alignment scoresQuervERCC基因的BLASTA同源性比对Homology of ERCC1 gene using BLASTA software （删除）第八外显子72bp序列GTGACTGAATGTCTGACCACCGTGAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGTCAGACCCTCCTGACCACATTTGGA2. ERCC1全长及缺失第VHI外显子变异剪接体TA质粒的构建（这一节属方法部份，放到方法里）试验流程如下:2.1材料与试剂2.1.1 标本标本组织来源来自正常卵巢组织（标本来源单位，时间，何种病人，正常人 是不可能被切卵巢的），标本切下后迅速置于液氮中保存直至提取 RNA时取出 质粒与菌株大肠埃希菌（DH-5 d） Escherichia Coli, E.Coli为本实验室保存留种。 pMD18-T TA克隆质粒够自日本Takara公司42, 43。其结构如下：EChgiiig4CT rgtHclci*PMD18-T质粒结构和酶切位点示意图The structure and en zyme site of pMD18-T Vector2.1.2主要仪器超速低温离心机TGL-16C台式高速离心机Gel doc 2000凝胶成像分析系统紫外可见分光光度计PCR扩增仪美国热电公司