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1、GST 标签的去除GST 标签的去除可在目的蛋白的功能或结构研究之前进行。根据目的蛋白的性质不同，完全消 化所需的蛋白酶量、温度、及孵育长度也各异。含有 PreScission 蛋白酶、凝血酶或 Xa 因子识别位点的标签蛋白可在与 Glutathione Sepharose 层析填料结合时切割，或者洗脱后在溶液中切割。当 GST 蛋白与柱结合时，切割释放了目的蛋 白，它与结合缓冲液一起洗脱，而 GST 部分仍与填料结合。一般来说，柱上切割是推荐使用的 方法，因为许多潜在的杂质都能洗掉，目的蛋白在洗脱时具有更高的纯度。如果需要优化切割条 件，建议洗脱后切割。从蛋白或肽段制备中去除丝氨酸蛋白酶如凝
2、血酶、 Xa 因子和 PreScission 蛋白酶，可利用Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 来进行，此填料有大包装。为了方便， BenzamidineSepharose 4 Fast Flow 也有预填充的 HiTrap Benzamidine FF 1 ml 和 5 ml 柱。凝血酶 凝血酶能够对带有可接近的凝血酶识别序列的融合蛋白进行位点特异的切割，用于消化包含凝血 酶识别序列的pGEX载体所制备的GST标签蛋白（pGEX-1入T、pGEX-2T、pGEX-2TK、 pGEX-4T-1、pGEX-4T-2 及 pGEX-4T-3）。在 22OC, IxP
3、BS 中，一个单位的酶 16 小时可切 割100 pg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。Xa因子纯化自牛血浆的Xa因子特异切割四肽lle-Glu-Gly-Arg之后的蛋白，可用于消化包含此序列的pGEX 载体所制备的 GST 标签蛋白（pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2 和 pGEX-5X-3）。在 22OC， 1 mM CaCl2、 100 mM NaCl 和 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）的反应体系中，一个单位 的酶16小时可切割100 pg待测GST标签蛋白，切割效率在90%以上。PreScission 蛋白酶PreScission蛋白酶是一种遗
4、传改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C蛋白酶和GST组成。这种蛋白 酶是专为蛋白酶的去除而设计，能实现同时的蛋白酶固定和pGEX-6P载体（pGEX-6P-1、PGEX-6P-2和pGEX-6P-3）所产生的GST融合蛋白的切割。PreScission蛋白酶特异切割Glu 和Gly残基之间的识别序列LeuGluValLeuPheGInGlyPro。蛋白酶在4七具有最大活性，因此 切割在低温下进行，改善了目的蛋白的稳定性。在5OC，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反应体系中，一个单位的酶16小时可切割100 pg待测GST 标
5、签蛋白，切割效率在90%以上。GST标签蛋白可通过亲和层析，利用固定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。GST与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。洗脱在温和、非变性的条件 下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品Glutathione Sepharose填料（表1）也有多种形式, 从预填充的MultiTrapT 96孔过滤板到预装柱的SpinTrapT、GraviTrapT、HiTrap及 HiPrepTM柱，或实验室包装（填料包装的体积从25 ml到500 ml）。不同的形式提供了从微克 到克规模的样品的纯化选择。表 1. Glu
6、tathione Sepharose 填料的特征Characten stiesGlutathi oneSepharose High PerformanceGlutathioneSeph 口rxse4 Fast FlowGlutathioneSepharose 4BMatrixHighly cross-finked. 6% agaroseHighly cross-linked. A% aga rose4% agaroseAverage partic)e size34 pm90 (jmBinding capacity1 10 mg 10 ng 10 mgRecommended flaw rate2
7、 150 enn/hSO-SOO cm/hkm.1 raf rinUfa1每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。GST蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象和浓度。GST与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通常会提高结合能力。这对于上 样过程很重要。蛋白性质、pH和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。2 室温下的水。仪器的选择将取决于特定的纯化。在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的GSTrap柱进行分步梯度洗脱。GST MultiTrap 96孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达500 pg GST标签蛋白
8、。每根GST SpinTrap柱能纯化多达500 pg蛋白。对于更大量的纯化，预装柱如GST GraviTrap、 GSTrap 和 GSTPrep 16/10 则提供了卓越的形式。GST SpinTrap 柱GST SpinTrap 柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。柱的设计可用于微型离心 机。每根柱子含有50 pl Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多500 pg重组GST。柱子在 含有0.05% KathonT （种抗菌的防腐剂）的IxPBS缓冲液中经过了预平衡。每个包装含有 50 根柱子。随机选择大肠杆菌转化物，这些转化物中含有表达带GST标签的人
9、肌红蛋白的cDNA,之后表 达，并用GST Spin Trap柱进行纯化。人肌红蛋白的cDNA与线性化的pGEX-5X-1连接，并转 化大肠杆菌BL21细胞。24个随机选择的克隆接种到3 ml培养基中，过夜培养。用IPTG诱导 表达2小时。取每个培养物1.5 ml,通过反复冻融步骤制备裂解液，再上样到GST Spin Trap柱 中。取每种还原型谷胱甘肽洗脱液的等份，上样到SDS凝胶中，用于SDS-PAGE的分析（图1）。结果显示，24个转化物中的7个表达了带GST标签的肌红蛋白。-GST-myoglobiri-G5T144009700066 000ii5 00030 00020100 .M
10、G 1315 16 17 18 19 20 21 22 23 24Mr97000660004500030000 *-GST- myoglobiri-GST20100 *生物通wMw；eW iCitr-sde.cam图1.筛选24个随机选择的含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA的大肠杆菌转化物，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。M = LMW-SDS Marker Kit。1-24泳道含有利用还原型谷胱甘肽 从GST Spin Trap柱上洗脱下来的产物。GST GraviTrap 柱GST GraviTrap是方便的一次性柱子，其中预装了 2 ml Glutathione Sepharo
11、se 4B，足够纯化最多20 mg GST标签蛋白。每个包装含有10根预装柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。特殊 的釉料保护填料在纯化过程中不会变干oGST GraviTrap柱在送达时的包装可便利地转化成柱子 支架（Workmate）。产品包装中的塑料托盘可用于收集废液。当处理体积超过10 ml时，将Labmate PD-10 Buffer Reservoir与柱子连接，能将上样量增加至大约35 ml。GST Bulk 试剂盒GST Bulk 试剂盒含有 10 ml 大包装的 Glutathione Sepharose 4B 和 5 根一次性的柱子。有了这 个试剂盒，GST标签蛋白可利用柱层析
12、或分批法进行纯化。GST Bulk试剂盒含有足够的试剂， 能纯化最多50 mg GST标签蛋白。GST MultiTrap 96 孔过滤板GST MultiTrap 96孔过滤板目前有两种选择：GST MultiTrap FF和GST MultiTrap 4B,分别预 装了 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 和 Glutathione Sepharose 4B。两种产品都能提供高 重复性、高通量的筛选，从不澄清或澄清的样品中小规模快速纯化GST标签蛋白。典型的应用 包括不同重组子的表达筛选，蛋白可溶性的筛选，以及小规模平行纯化条件的优化。利用 GST Mult
13、iTrap可直接从不澄清的细胞裂解液中纯化最多500 pg GST标签蛋白/孔，缩短了操作时间， 将敏感目的蛋白的降解降至最低。 96孔板形式具有很大的灵活性，可与自动化的机器人系统共 同使用，也可通过离心或抽真空手工操作。孔与孔之见、板与板之间的一致性能确保了高重复性。利用GST MultiTrap FF来设计缓冲液筛选研究，确定纯化GST-海马钙结合蛋白的最佳缓冲液 条件。检测的参数有缓冲液、pH、氯化钠、甘油、DTT和谷胱甘肽。同时还进行了超声破碎与 市售细胞裂解试剂盒的使用效果比较。利用MODDEtm软件（Umetrics）来进行因子设计（实验 设计）和统计分析。不同缓冲液条件和样品制
14、备方法随机应用到过滤板中。样品、结合缓冲液或洗涤缓冲液中谷胱甘肽的存在显著降低了纯化的GST-海马钙结合蛋白的产 量，而缓冲液对产量无影响。低pH改善了产量，而pH和添加剂如DTT、甘油或氯化钠未显著 影响纯度（图 2）。筛选结果表明，对于GST-海马钙结合蛋白的纯化，获得最高产量和纯度的缓冲液条件是介于10 到20 mM的磷酸钠，140到400 mM的NaCl, pH 6.2-7.4。样品制备可通过市售的细胞裂解试剂盒及超声破碎来进行，不会显著影响纯化结果。Mrg? ooo5000020 10014 10011 12LanesJ_GSPhippocdcin1. LMW SDS-Mcj rke
15、r Kit 7-04412. Stcirt iat&rial3 Son ication.lOmM PBS. 1-40 mN Na Cl. pH 7.4. Cel Lytic kit. lOmM PBS. 140mM NaCl. pH 7.45. Cel Lytic kit. 10 mM PBS.丸 Q m M NaC 1.2 mH glutath ione. 5 鳴 g t/wrol. pH 65. Sonication.ZO mN PBS, MJOmN NaCl, 394 gfyteroL pH &27. Son ication. 2.Q mN PBS, 4X)0 mM Ma Cl, 2 rn M glutathione. pH B3. Son icdtion. 50 mM Tri-HCl. 400 mM NaCl, 5% gl/ceral. pH 6.29 Son ication .50 mN TriHCl. pH 3LOL Sonication, 5Q mM Tris-HCl. WO mM NaCl. ?mHgkitatliione, 5 mM DTT5% glycerol. pHS11. Sonication. 100 mM Tris-HCl, 140mM NaCI
