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1、移植受者免疫抑制治疗影响外周血微量CMV DNA的变化【摘要】 目的:探讨移植术后免疫抑制治疗个体,外周血中巨细胞病毒脱氧核糖核酸（CMV DNA）的变化规律，并评价其潜在的临床应用价值。方法:通过对免疫抑制治疗个体、健康个体外周血微量CMV DNA的检测，分析CMV DNA与免疫抑制剂浓度的关系；同时对30例患者的连续标本进行配对实验，说明过度免疫抑制可导致微量CMV DNA的出现。结果:健康个体组、环孢素组、FK506组中微量CMV DNA阳性率分别达到0%、42.24%和11.8%，阳性组平均免疫抑制药物浓度明显高于阴性组（P<0.05），高药物浓度组阳性率明显高于低浓度组（P&l
2、t;0.05）。配对实验提供了相同的结果。结论:免疫抑制药物浓度影响微量CMV DNA动态的变化，部分反映了个体免疫抑制状态，对指导临床用药有一定的价值。 【关键词】 移植 免疫抑制 巨细胞病毒 Abstract: Objective:To investigate approved immunosupression concentration whether influence trace CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells of the posttransplantion. Methods: 294 cases of patients
3、(410 cases of blood sample) of post-transplantation and 96 cases samples of health check up were collected continuously in 2 months. Immunosuppression concentration and CMV DNA were measured with TDx，IMX and nested PCR respectively. Immunosuppression concentration of patients whose samples were cont
4、inuously detected CMV DNA positive and negative were analyzed by paired samples test. Result: CMV DNA was detected in 42.24% and 11.8% in CSA or FK506 treated patients but not in all 96 health check up individuals. As CSA concentration up to 200ng/ml, patients had highest CMV DNA positive rate 55.71
5、% (P<0.05）. The mean CSA and FK506 concentrations of CMV DNA positive group were higher than that of CMV DNA negative group (P<0.05）;paired samples test get the more significant result （P<0.05）. Conclusion: Nested PCR detected CMV DNA maybe an assay for indirectly evaluated immunosupression
6、 state of the posttransplantation. Key words: transplantation；immunosuppression；CMV 排斥或感染一直是移植受者服用免疫抑制药物必须面临的两大问题。而解决此矛盾的首要措施即是寻找一个能综合反映个体免疫状态的指标，建立评价个体免疫抑制状态的有效技术。国人抗CMV IgG阳性率接近100%，世界范围内亦有60%100%的感染率。根据CMV的潜伏感染特点，尝试以外周血微量CMV DNA作为评价免疫抑制状态的指标，采用敏感的巢式聚合酶链反应（nPCR）技术检测移植受者外周血中微量CMV DNA，并探讨其与免疫抑制程度的关系
7、。 1 材料和方法 1.1 免疫抑制药物浓度检测 受者的免疫抑制方案均以环孢素（CSA）或他克莫司（FK506）为主。服药前，抽取静脉血测全血CSA或FK506浓度谷值。CSA、FK506浓度分别采用酶免疫发光技术（仪器Abbott TDx）和微粒子酶免疫分析技术（仪器Abbott IMx）测定。 1.2 标本及分组 采用酶联免疫吸附试验检测受者及96例健康体检人员的血浆CMV IgG抗体，并检测CMV DNA。连续收集2006年10月至2006年12月移植随访者药物浓度检测血标本，共294例受者，410例次。移植随访者均为移植术后3个月以上。其中服用CSA为173人，服用FK506为121人
8、；男180例，女114例，平均年龄（44.3911.97）岁。根据免疫药物浓度（CSA以200 ng/ml或120 ng/ml为界线；而FK506浓度以5 ng/ml为界线）将其分组。另根据CMV DNA检测结果将其分为阳性组和阴性组。其中46例多次检测，当同一个体先后出现CMV DNA阳性和阴性时对其药物浓度进行配对比较（此两标本为连续收集的标本）。移植患者术前行常规CMV DNA检查，结果均提示阴性。移植患者术后第3周开始予更昔络维针250 mg/d预防病毒感染治疗，疗程1周。 1.3 DNA提取 收集环孢素浓度测定标本，取300l全血加入0.98%的NH4Cl 1ml破红细胞膜10 mi
9、n，离心后取白细胞加入300l细胞裂解液，充分混匀后放置10 min；加入蛋白质沉淀液150l充分混匀，离心5 min(12 000 r/min)；取上清液加入异丙醇300l沉淀蛋白质；以75%乙醇洗3次，待乙醇蒸发后加入溶解液100l，-20 保存。 1.4 核酸扩增 nPCR:根据CMV病毒基因组设计引物,第一次PCR扩增引物分别为P1 5-TCTAAGAC ATAGCAGCACAGCACC-3和P2 5-TGAAAAAATATACCCAGAC GGAAG-3；第二次PCR扩增引物分别为P3 5-AGCAC CCGACAGAACTCACT-3和P4 5-TATGGCTTATGCCCAGAA
10、AA-3。取1l DNA用于10l的 PCR体系，其中包括：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTP、0.45 U Taq polymerase、0.1M引物和5%甘油。第一次PCR条件为94 2 min后，进行30个循环，94 20 s，58 60 s，72 60 s；最后进行72 2 min延伸。完成后取1l PCR产物用于第二次扩增，94 2 min后，进行25个循环，94 10 s，55 30 s，72 30 s；最后进行72 2 min延伸。经2%的琼脂糖电泳，紫外分析仪上观察结果。标本
11、分别检测3次，出现一次阳性便判断为阳性。常规PCR:反应条件同上，循环次数增加到35次，引物分别采用P3、P4。 1.5 临床观察 对所有具CMV发病症状的受者进行常规pp65检测。通过核对pp65记录，回顾性分析CMV DNA阳性受者是否出现CMV发病的典型症状。 1.6 统计学处理方法 对CMV DNA阳性、阴性两组环孢素、FK506浓度进行student T test分析。采用卡方检验分析不同免疫抑制药物浓度组CMV DNA阳性率的差别。配对两组进行非参数Mann Whitney检验。 2 结果 2.1 CMV DNA阳性受者平均免疫抑制药物浓度高于阴性受者 所有受者和96例健康体检者C
12、MV IgG均为阳性。232例次标本的平均环孢素浓度为（165.4289.90）ng/ml，CMV DNA nPCR检出率为42.24%（98/232），常规PCR未能检测到阳性结果（0%）；96例健康体检个体采用nPCR未检测到CMV DNA。CMV DNA阳性组环孢素浓度明显高于CMV DNA阴性组，两者差异有显著性（见表1）。在服用FK506的患者中亦有相同结果（7.9434.22）ng/ml vs（6.3143.92）ng/ml；P=0.025，其中10例患者前后配对实验亦显示有相近的结果（P0.05）。 2.2 高药物浓度组CMV DNA阳性率增加 同样，以6 ng/ml为界FK50
13、6高浓度组微量CMV DNA阳性率明显高于低FK506浓度组（P0.05），有统计学差异。 2.3 CMV DNA阳性结果并非CMV发病 所有受者中8例出现临床类似症状，怀疑CMV感染需要检测pp65抗原，但结果均为阴性，不能诊断为CMV抗原血症或CMV发病。8例患者中两例受者可检测到微量CMV DNA。 3 讨论 CSA、FK506是从土壤真菌中提取的抗生素，具有强大的免疫抑制作用，是移植后免疫抑制治疗方案的主要成分。但是过度的免疫抑制会造成严重的不良后果，其中，感染是移植术后受者死亡的主要原因，了解免疫抑制治疗是否应用过度是预防发生感染的重要手段。临床观察发现外周血中高浓度的免疫抑制药物可
14、导致多种感染的发生，由于缺乏免疫抑制状态的评价指标而仅能通过临床经验进行治疗，如术后1个月内服用更昔洛韦和磺胺类药物预防感染发生。 CMV是免疫抑制受者最易感染的病原体之一。主要原因是CMV在初次感染产生免疫应答后，还可在体内潜伏感染。在这种潜伏感染状态下，采用nPCR方法检查，健康个体外周血中极少出现微量CMV DNA（0.2%）1，2。个体免疫状态是决定CMV发病的主要因素，孕妇、新生儿、艾滋病患者、肿瘤患者和免疫抑制剂使用者发病几率明显高于正常个体3。目前普遍采用抗pp65蛋白抗体标记外周血白细胞，呈阳性者可诊断为CMV抗原血症提示CMV发病，或通过荧光定量PCR检测CMV DNA诊断C
15、MV病3。nPCR比传统PCR具有更高的灵敏度，其检测范围亦高于荧光定量PCR技术，但是其阳性结果并不提示发生CMV病。 目前为止，尚未建立评价个体免疫状态的指标或系统。如果以体内潜伏的病毒作为靶目标，检测此微量病毒可能对评估整体免疫是一个有效手段。nPCR可检测到极微量CMV DNA，我们发现移植术后接受免疫抑制治疗的受者中42.24%在其外周血中可检测到CMV DNA，而96例健康体检的个体无一例呈阳性结果。就潜伏感染个体而言，随着免疫抑制药物浓度上升必然发生CMV病4，移植最初的3个月内血CSA谷浓度可超过200 ng/ml，是需要抗病毒预防治疗的阶段。nPCR证实当免疫抑制达到此水平时
16、可使55.71%的患者体内潜伏CMV激活并可检测到微量CMV DNA。如果未见明显症状，这时机体的免疫状态同CMV达到一个平衡，即受者不能完全清除CMV又不发病。我们发现当免疫抑制药物浓度升高时CMV DNA阳性率亦增加，可出现伴随药物浓度的升降而出现CMV DNA阳性、阴性的动态变化可以认为微量CMV DNA间接反映了免疫抑制程度。但是并非所有使用免疫抑制受者都会出现微量CMV DNA，微量CMV DNA阴性的个体CSA浓度处于相对较低水平，这部分受者在本实验期间亦未出现急性排斥症状，证实有效的免疫抑制可以同时避免排斥发生和CMV激活。但在环孢素浓度小于120 ng/ml组中尚有32.9%的患者有微量CMV DNA存在，可能提示其个体因素（如对免疫抑制药物敏感）或与其他免疫抑制剂联合用药而存在过度免疫抑制。由于缺乏评
