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1、小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验摘要目的：1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感 性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模 型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色 的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（HCa - F）经615小鼠右腋中 线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹 股沟淋巴结肿大情况，并于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体 及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的 形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器 做切片处理以作染色
2、和镜下观察。结果:21天 观察，实验使用10只小鼠，最终存活8只，其中形成 肿块7只（3只形成的肿 块较大），成瘤率70%，淋巴结转移率70%。 肉眼观察，较大肿瘤2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开， 发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下 观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤 细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。 核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。 结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移， 且具有高转移力。关键词HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞）；6
3、15小鼠；高淋巴道转移 前言研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常 见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌 的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm 一下的小肝癌已被发 现并及时治疗取得满意的疗效1。随着临床治疗经验的积累，逐渐 意识到即使是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问 题，术后5年复发率可高达50%。存在的问题:本次试验采用的方法是将瘤细胞移植于615小鼠右腋中 线皮下，观察肿瘤生长及转移状态2。所以移植瘤没有展现自发性 肿瘤从正常组织转变成肿瘤、随后出现转移的全过程，没有了解疾病 完整的自然史。实验的意义:为了探究肝癌的实质性问
4、题，即肿瘤本身的生物学特性， 尤其是其转移的生物学特性，本次试验对肝癌转移的生物学行为进行 实验性研究。即将肿瘤细胞直接接种到小鼠的皮下组织 然后观察肿 瘤细胞在小鼠体内的生长及转移情况。它基本上模拟了从肿瘤生长到 转移瘤形成的一系列步骤，又涉及宿主的反应性，因此结果可靠，近 似于临床病人的实际情况，对提高恶性肿瘤患者的生存率和预后有重 要的意义3。正文一、材料1、细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教 研室建株并保存。2、实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重18-22g， 由大连医科大学实验动物中心提供。3、主要试剂及器皿搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射
5、器、手术 刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、 75%酒精棉、10%甲醛固定液等。二、方法1、细胞系获取从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F）塑料冷冻管，立即放入40摄氏度的温水中，1分钟内是冷冻液全部融化，立即送入无菌室。取出细胞悬液放入离心管中，用生 理盐水洗涤2次，离心，弃上清，再加1 ml生理盐水吹打均匀。向小 鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件去腹水。2、615小鼠皮下接种肿瘤细胞 取615小鼠癌性腹水0.1ml，内含 2*106个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下。局部严格消毒。 选择右腋皮下接种。定期检查右腋
6、皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及 腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体 及双侧淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于 10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。3、组织取材 将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切 成23mm的小于2cm*1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组 织一般固定数小时，较大标本需固定2448小时。经冲洗（用递升浓 度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将 组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木 精-伊红染色。4、切片染色石蜡切片法、HE染色法。脱水程序及时间
7、：组织固定，冲洗，然后：1) 脱水：以下列顺序进行：60%酒精30分钟一80%酒精12小时 -95%酒精24小时或过夜一95%酒精24小时-100%酒精24小 时-100%酒精24小时或过夜。2) 透明：二甲苯I 3045分钟；二甲苯II 3045分钟。3) 浸蜡。蜡碗I、II、III (各3045分钟)；包埋。4) 修蜡块：修蜡块，贴号。5) 切片。6) 烘烤。烘烤切片6070摄氏度，1小时。7) 染色。HE切片染色程序与方法1) 切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯I、I各510分钟。无水酒精3-10分钟(消除二甲苯)一95%酒精13分钟-80% 酒精13分钟-70%酒精13分钟-50%酒
8、精13分钟一自来水冲 洗5分钟以上(洗去切片上的酒精，切片透明)一蒸馏水清洗(防 止污染苏木精染液)。脱蜡是水化过程，目的是通过酒精的缓冲 作用，易于水洗与染色。因为染剂是水，从无水酒精直接放入染 液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。 而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。2) HE染色 苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的 过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核 呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。苏木染色（染核）515分钟一自来水冲洗35分钟一0.5%盐酸 酒精溶液分化数秒钟一自来水洗1
9、5分钟一弱碱性水溶液显蓝3060 秒一自来水冲洗510分钟一蒸馏水洗12次一伊红1分钟一蒸馏水 洗12次。3）脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除 出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固， 便于观察和长期保存。80%酒精3040秒一95%酒精3060秒一无水酒精I 15分钟一无 水酒精1115分钟一二甲苯I 15分钟一二甲苯1115分钟一中性树 胶封固。5、镜下观察。三、结果21天观察10只小鼠，最终存活8只，其中形成肿块7只，3只形成 的肿块较大。成瘤率70%，淋巴结转移率70%。肉眼观察：淋巴结较 正
10、常增大，皮下瘤体较大，与皮下组织粘附紧密，肝和肾脏可见肿瘤 结节，较大肿瘤2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发 现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观 察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细 胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。 核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。四、讨论将小鼠右腋皮下腋下作为肿瘤细胞的接种部位是其由于此处的 淋巴结相对较多，且有血循环丰富，利于肿瘤的转移。人体内对抗癌 细胞的功能主要由免疫系统承担。免疫系统被肿瘤细胞阻塞，淋巴液 就会向相反的方向流动，导致不符合
11、常规的转移现象。小鼠腹水型肝癌细胞瘤株属于小鼠肝细胞癌。由于615小鼠淋巴 系统比较发达且有许多近交系，部分近交系有其特定的自发性肿瘤， 可利用其自发肿瘤与人体肿瘤的相似之处做为动物模型进行肿瘤发 生、发展和治疗的研究。同时，胸腺严重缺陷的裸小鼠可接受人类各 种肿瘤细胞的植入，成为活的癌瘤细胞试管，是研究人类肿瘤生长 发育、转移和治疗的绝佳动物。在本实验中观察到的肿瘤细胞的异型性准要表现在以下几个方 面：1肿瘤细胞的多形性表现为瘤细胞大小不一，形态不规则，甚 至出现胞体特大的瘤巨细胞。少数分化差的肿瘤细胞较相应组织的正 常细胞小，圆形，且大小较一致。2 核的多形性细胞核大小不一， 形态不规则，
12、甚至出现多核、巨核、畸形核瘤细胞。肿瘤细胞核明显 增大，因而使核/浆比例增大，从正常的1:46增至1:1.52,甚至1:1。 核染色质呈粗大颗粒状，分布不匀，常靠近核膜分布，使核膜显得增 厚。核仁肥大，数目增多。核分裂像多见，并可出现病理性核分裂， 即多极性、不对称性、顿挫型核分裂。恶性肿瘤细胞核多形性与染色 体呈多倍体或非整倍体有关。3胞质的改变恶性肿瘤细胞的胞质一 般由于分化低而减少，但有时也可以增多。由于胞质内核蛋白体增多， 故多呈嗜碱性染色。此次试验便是通过建立小鼠腹水型肝癌淋巴道 高转移细胞系HCaF细胞模型，对肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学 特性有所了解。通过模型的建立，染色制片，镜
13、检等一系列的过程建 立了科研的学术观念，掌握了相关的专业知识。恶性肿瘤细胞转移的可能机制有1、淋巴道转移2、血道转移3、 种植性转移。本实验中重点研究淋巴道转移，恶性肿瘤侵入淋巴管后， 随淋巴流首先到达局部淋巴结。局部淋巴结发生转以后，可继续转移 至下一站的其他淋巴结，最后，可经胸导管入血再继发血道转移。值 得注意的是，有的肿瘤可以逆行转移或者越过相应的引流淋巴结发生 跳跃式转移。肿瘤细胞一般经血液和淋巴道转移，在实验中经过HE染色可以 观察到肝脏和肾脏有转移瘤，因而可以推断小鼠腹水型肝癌细胞经过 了转移，而且在淋巴结中也发现了肿瘤细胞，也能说明小鼠腹水型肝 癌细胞经过淋巴道转移。本实验结果可
14、以为预防恶性肝癌转移提供较 为清晰的预防思路。参考文献1李甘地，来茂德.病理学.人民卫生出版社,2001: 2612李连宏，唐建武，孙雷.医学形态实验学.人民卫生出版社,2009 ： 973孙成荣，唐建武，孙明忠，采用定量蛋白组学技术筛选小鼠肝癌 淋巴道转移相关蛋白.生物化学与生物物理进 展，2007,34(8):8568644 张宏颖，刘春平，唐建武,许国旺，等.姜黄素对小鼠腹水型肝癌高 淋巴道转移细胞株(HCa-F)生物学行为的影响.中国科学院上海冶金 研究所；材料物理与化学(专业)博士论文2000年度5 Sobel MW.J Natl Cancer Inst,1990;82:2676 S
15、aigoh K, Wang YL, Suh JG, et al. Intragenic deletion in the gene encoding ubiquitin carboxy-terminalhydrolase in gad mice J. Nat Genet. 1999, 23(1):4751.6、BurelillSA,et al.Br J Cancer,1995;71:2787 李海燕，方肇勤,梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中 医药抗肿瘤中的应用.中国中医基础医学杂志,2000,6,1,278 凌茂英，刘希风,郑怀祖，等.小鼠肝癌细胞系H22-F25/L的建立及 其生物学特性.中华肿瘤杂志，1991,13(1):13.9 陈桑，凌茂英，刘希风，等.小鼠腹水型肝癌高、低转移克隆稳定 性的研究J .大连医学院学报，1992, 14: 32- 37.10 张宏颖，唐建武，朱文婷，胡春秀，许国旺.小鼠腹水型肝癌淋 巴道高转移细胞系HCaP/L6细胞模型的建立及其药物敏感性的评 价.大连医学院学报，2008，30(5)： 465-468 .
