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1、材料与方法1.1 材料与试剂法国梧桐叶、法国梧桐落果 采集于新乡市洪门镇。正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸 均为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸分析纯（中国莱阳市双双化工有限公司）；AlCl3 (10%)；CH3COOK (1 M)；DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)为Sigma公司产品； DMSO (二甲基亚砜)；FeSO47H2O (10 mM)；EDTA（乙二胺四乙酸酸根离子,10 mM）；2-脱氧核糖（10 mM）；磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH7.4）；H2O2（10 mM）；TCA（三氯乙酸2.8%）；TBA（二硫代巴比妥酸1
2、%）；磷酸盐缓冲液（pH6.6）；K3Fe(CN)6 (铁氰化钾，1%)；TCA（三氯乙酸10%）；FeCl3(0.1%)；蒸馏水 实验室自制。1.2仪器与设备 KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DHG-9070型电热古风恒温干燥箱 上海市三发科学仪器有限公司；BS124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-8型水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；HH-S精密数显恒温水浴锅 常州市国立试验设备研究所；WB-2002水浴锅 郑州长城科工贸有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Anke TG
3、L-16B 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂 ；SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州国瑞仪器有限公司；低温冷却循环泵 郑州长城科工贸有限公司。1.3实验方法1.3.1 提取与萃取将粉碎好的法国梧桐叶和果实分别乘装于10L广口瓶内，用90%乙醇和95%乙醇溶液浸泡于50 恒温水浴锅中，加热回流提取24 h。对提取液用旋转蒸发仪进行浓缩蒸干，以上过程重复三次，得法国梧桐叶和果实提取物，再分别向法国梧桐叶和果实提取物中加入水，以正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇的顺序按1:1的比例进行萃取；每种溶剂萃取三次，最后得到水层。去除溶剂得到的法国梧桐叶和果实提取物和各层萃取物组分。1.3.2 DPPH
4、自由基清除能力的测定原理：DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，在517 nm处有最大吸光度,其醇溶液呈紫色。当它遇到自由基清除剂时，与自由基清除剂配对，化合物溶液从紫色变为淡黄色。此时，DPPH基团在517 nm处的吸光度减小，由于褪色程度与电子数量成定量关系，因此可以通过测定加入样品时的517 nm下的吸光度变化，从而求得该样品对自由基的消除率1。样品对DPPH自由基的清除能力依据Yen和Chen（1995）2,3的方法修改后来测定样品清除DPPH自由基的能力。即Ao: 0.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液+0.5 mL试样溶剂，Ai：0.5 mL 0.2 mmol/L的D
5、PPH甲醇溶液+0.5 mL待测样品溶液，Aj: 0.5 mL样品溶液+ 0.5 mL试样溶剂,混合均匀后室温下于暗处静置30 min，然后在517 nm处测定吸光度。由下面的方程式（1）计算样品对DPPH自由基的清除能力：消除效率（%）=1-(Ai-Aj)/Ao100 （1）其中：A0为对照组的吸光度Ai为测试组的吸光度Aj为空白组的吸光度方法：将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和95%乙醇层待测样品分别配制成25、50 、100 g/mL的一系列溶液，然后配制Ao、Ai、Aj，最后测定对应待测样品浓度的吸光度，每个样品的每个浓度重复3次。计算DPPH自由基清除率和不同层样品
6、对DPPH自由基清除能力的EC50值，并绘制DPPH自由基清除率对样品浓度柱状图。1.3.3 羟基自由基消除能力的测定原理：Fe3+的螯合物(如Fe-EDTA)存在下的Fenton型Haber-Weiss反应可产生OH，反应方程式为：Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- +OH工艺上将Fe2+和H2O2的组合成为Fenton试剂4。反应生成的羟基自由基能够进攻2-脱氧核糖，使其降解生成丙二醛。氧化产物丙二醛能够与硫代巴比妥酸进行显色反应，生成粉红色物质在532 nm处有最大光吸收。如果在溶液体系中加入具有清除OH功能的被测物质，它可以与2-脱氧核糖竞争羟基，使产生的红色物质减少，即53
7、2 nm处的吸光度减小。因此可以通过测吸光度间接测其对羟基自由基的清除作用5。由下面的方程式（2）计算样品对羟基自由基的清除作用：消除效率（%）=（1-As/Ao） 100 （2）其中：As为待测溶液的吸光度 Ao为对照组溶液的吸光度方法：将正己烷层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层和95%乙醇层待测样品分别配制成250 、500 、1000 g/mL的一系列溶液，先后依次加入100 L的FeSO47H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100 L各浓度的样品溶液（空白对照组加入100 L样品溶剂水）、500 L磷酸缓冲溶液，100 LH2O2于试管中,于37水浴加热4小时。然后加入三氯乙酸(
8、TCA)、二硫代巴比妥酸（TBA）各500 L。 之后将它们放在100恒温水浴锅中加热十分钟后，冷却至室温后在3000 rpm下离心5分钟。最后分别测定各样品在532 nm下的吸光度，每个样品的每个浓度重复3次。计算对应待测样品浓度时其对羟基自由基的清除率，并绘制清除率对样品浓度柱状图。1.3.4 还原能力测定在还原能力测定实验中，来自样品中的抗氧化剂能将铁氰化钾中的Fe3+ 还原成Fe2+，Fe2+ 进一步生成在700nm处有最大吸光值的Perl 普鲁士兰，因此测定700 nm处吸光值的高低可以间接反应抗氧化剂还原能力的大小6。将法国梧桐落果提取物样品配制成系列浓度： 250、500、100
9、0 g/mL，分别移取各浓度的样品0.2 mL于试管中加入磷酸盐缓冲液(pH 6.6) 0.5 mL再加入1%铁氰化钾溶液0.5 mL在50 下反应30分钟。然后加入10% 三氯乙酸溶液0.5 mL 充分混和均匀，3000 rpm下离心10分钟。移取上清液0.5 mL于试管中，加入0.5mL 蒸馏水，再加入0.1% 三氯化铁0.1 mL，常温下反应5分钟，然后使用紫外可见分光光度计于700nm波长下测定吸光值。同时做空白对照组，不加样品，加入0.2 mL蒸馏水。根据各反应组吸光度的高低评价法国梧桐落果95%乙醇提取物、各萃取层和法国梧桐叶子90%乙醇提取物、各萃取层的抗氧化能力。吸光度越高表示
10、还原能力越强。2.结果与分析2.1法国梧桐果实实验结果：2.1.1. DPPH自由基清除能力的测定结果及讨论1) 样品对DPPH自由基的清除率数据见表1： 表1 样品对DPPH自由基清除率（%）数据样品25g/mL50g/mL100g/mL95%EtOH萃取物14.2717.3121.90C6H14萃取物6.7611.0512.29CH2Cl2萃取物4.369.2322.71EtOAc萃取物21.4622.3254.94BuOH萃取物9.5582.6897.90H2O萃取物47.7148.3974.872) 样品对DPPH自由基清除能力柱形图见图1图1 DPPH自由基清除能力柱形图可以看出，各
11、个萃取层的DPPH清除能力均随着浓度的增加而增强。其中95%EtOH层，MC层，EA层和Bu层随浓度变化效果明显，100ppm均比50ppm增加10%以上，EA层达到了32.62%。MC层、EA层、Bu层，DPPH自由基清除能力整体随着极性的增加而增加，Bu层的50ppm比25ppmDPPH自由基清除能力有显著的提高，达到73.13%。由此可见Bu层有一定的科研价值，值得进行深入研究。2.1.2还原能力测定结果及分析1） 不同层样品还原能力的测定数据见表2表2样品的还原能力的测定数据样品250g/mL500g/mL1000g/mL95%EtOH提取物0.2180.2570.281C6H14萃取
12、物0.1710.1750.179CH2Cl2萃取物0.2920.3600.394EtOAc萃取物0.3290.3940.426BuOH萃取物0.2400.2940.336H2O萃取物0.0310.0310.0312.2不同层样品还原能力的测定柱形图见图2图2 样品还原能力的测定柱形图从表中和图中可以看出来95%EtOH层、Mc层、EtOAc层、Bu层的还原能力较强，并且随着浓度的加大，其还原能力也随之增强，其中Mc层和EtOAc层的还原能力较为突出。水层的还原能力较弱，且随浓度的加大其还原能力基本保持不变，可能是前几个萃取层对具有还原能力的化学物质萃取的效果比较充分。其中，Mc层和EtOAc层
13、相对于其他各萃取层有一定的研究价值。不过总体来说比较国内外文献，还原能力偏弱。2.1.3 羟基自由基消除能力的测定结果与分析1) 不同层样品羟基自由基消除能力的测定数据见表3表3 样品对羟基自由基清除率（%）数据样品250g/mL500g/mL1000g/mL95%EtOH提取物53.2462.4465.44C6H14萃取物43.9250.5752.66CH2Cl2萃取物43.2955.3357.82EtOAc萃取物40.9548.0651.20BuOH萃取物36.0136.7641.20H2O萃取物23.4629.6142.542) 不同层样品羟基自由基消除能力的柱形图见图3图3 样品羟基自
14、由基清除能力测定柱形图从表3和图3可以看出，各个萃取层对羟基自由基的消除能力均随着样品浓度的增大而增强。且除了95%EtOH层外，从H层到W层，各萃取层的对羟基自由基的消除能力有下降趋势。95%EtOH层对羟基自由基的清除能力效果最好，250g/mL，500g/mL，1000g/mL 对羟基自由基的清除能力分别达到53.24%，62.44%，65.44%。且H层，Mc层，EA层对羟基自由基的消除能力相差不大，可以进一步深入研究。2.2法国梧桐叶的研究实验结果2.2.1 DPPH自由基清除能力的测定结果及讨论1 ) 样品对DPPH自由基的清除率数据见表1：表1 样品对DPPH自由基清除率（%）数
15、据样品50g/mL100g/mL250g/mL500g/mL1000g/mLEtOH提取物3.414.1912.2019.8033.80H萃取物6.576.067.1319.4021.90Mc萃取物12.2017.5024.3028.2037.70EA萃取物11.5013.9023.6040.4077.10Bu萃取物11.5015.1025.4051.6074.70W萃取物5.5213.4014.8025.7055.102) 样品对DPPH自由基清除能力柱状图见图1图1 DPPH自由基清除能力柱状图由上图可以看出，各个萃取层样品的DPPH自由基清除能力随浓度的增加而增加，且在50g/mL是各层样品的清除能力相差不大。EtOAc层、Bu层，和W层样品的DPPH自由基清
