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1、精品文档1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在 SDS PAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是 TrisHCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,别离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用 的Tris甘氨酸缓冲系统.在浓缩胶中,其 pH环境呈弱酸性,因此 甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而 CL 离子却很 高,两者之间形成导电性较低的区带, 蛋白分子就介于二者之间泳动. 由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度, 压着蛋白质分子聚集到一起, 浓缩为一狭窄的区带. 当样品进入别离 胶后,由于胶中 pH 的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增 加,直接紧随氯离子之后, 同时
2、由于别离胶孔径的缩小,在电场的作 用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行别离.所以, pH 对整个反响体系的影响是至关重要的,实验中在排 除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素.2. 样品如何处理？ 根据样品别离目的不同,主要有三种处理方法：复原 SDS 处 理、非复原SDS处理、带有烷基化作用的复原 SDS处理.1复原SDS处理：在上样buffer中参加SDS和DTT 或Beta 巯基乙醇后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成 SDS 与蛋白 相结合的分子,在电泳中, 只根据分子量来别离.一般电泳均按这种 方式处理,样品稀释适当浓度,参加上样Buffer,离心,沸水
3、煮5min, 再离心加样.2带有烷基化作用的复原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团,得到较窄的谱带；另碘乙酸 胺可捕集过量的 DTT ,而预防银染时的纹理现象. 100ul 样品缓冲液 中 10ul 20的碘乙酸胺,并在室温保温 30min .3非复原 SDS 处理：生理体液、血清、尿素等样品,一般只 用1%SDS沸水中煮3min,未加复原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不 可作为测定分子量来使用.3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用： 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体, 其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关；
4、制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7,别离胶选择pH8.9,选择tris HCL 系统, TEMED 与 AP： AP 提供自由基, TEMED 是催化剂, 催化自由基引起的聚合反响进行；十二烷基硫酸钠SDS:阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠.4. 提升SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合,可提升凝胶的分辨率.建议做法：待 凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用.忌即配即用或 4 度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致 SDS 结晶.一般 凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺.一般常用的有氨基
5、黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染 料又各自不同的染色方法, 具体可参照郭尧君编著的 ?蛋白质电泳技 术手册? P82-103.5. “ 微笑两边翘起中间凹下形带原因？ 主要是由于凝胶的中间局部凝固不均匀所致, 多出现于较厚的 凝胶中.处理方法：待其充分凝固再作后续实验.6. “皱眉两边向下中间鼓起形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中, 一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净.处理方法：可在两板间参加适量缓冲液,以排除气泡.7. 为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或别离胶浓度过大引起的. 处理方法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长,重
6、新配制；降低凝胶浓度.8. 为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的. 处理方法：加样前离心；加适量样品促溶剂.9. 什么是“鬼带,如何处理？“鬼带 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时, 常会出现 在泳道顶端 有时在浓缩胶中 的一些大分子未知条带或加样孔底部 有沉淀,主要由于复原剂在加热的过程中被氧化而失去活性, 致使原 来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分 子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入别离胶.但它却于目标 条带有相同的免疫学活性, 在 WB 反响中可见其能与目标条带对应的 抗体作用.处理方法：在加热煮沸后,再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙
7、 醇,以补充缺乏的复原剂；或可加适量 EDTA 来阻止复原剂的氧化.10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未 跑下来的现象.主要与缓冲液和别离胶的浓度有关.处理方法：更换正确 pH 值的 Buffer ；降低别离胶的浓度.11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因. 处理方法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正 确6.7；适当降低电压；12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现. 比方电压 50v 以上,可电流却在5mA 以下.主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通
8、路.包 括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉比 如倒胶用的橡胶皮.处理方法：电泳槽正确装配即可.13. 浓缩胶与别离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中, 一般对电泳不会有太大的影响. 前者 主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致； 后者是由于在解除制胶的 夹子后,板未压紧而致空气进入引起的.14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事？通常胶在 30MIN-1H 内凝.如果凝的太慢,可能是 TEMED ,APS剂量不够或者失效.APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被 氧化成黄色. 如果凝的太快,可能是 APS和TEMED用量过多,此 时胶太硬易裂,
9、电泳时易烧胶.15. 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误,即缓 冲系统地 PH 和被别离物质的等电点差异太小,或缓冲系统的离子强 度太高.我们实验室的传统也是将倒完的胶放在冰箱内过夜凝聚, 第二天跑胶 效果非常好.我想主要原因并不在于低温,而在于过夜时间长,让胶 凝聚得非常充分而且均匀.反之,在 37 温箱内虽然凝得很快,但是 容易出现胶脆,凝聚不均匀等情况.我想只要你得配液没问题,那么 适当延长凝胶时间肯定效果会好些！ 温度的上下决定了胶聚合的速度：高温有助于胶的聚合.但是,胶聚 合得越快,其脆性也越大.因此,一般把胶的聚合时间限制在 40-60 分钟
10、左右为宜. 当然,灌胶后放入 4 度聚合,其聚合时间会大大延长, 但是其脆性也会大大降低上层的浓缩胶用的是 Tris-HCL 缓冲液, PH6.8, HCL 的解离度大, 几乎全部成 CL- ,CL-在电场中移动最快.而电泳槽中含有甘氨酸,在PH6.8时只有少量解离,在电场中移动的最慢.蛋白质被夹在中间就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了.下层的别离胶用的是Tris-甘氨酸缓冲液,PH8.8,在此PH下,甘 氨酸解离度增大,泳动速度增加并超过了蛋白质, 原先的电位梯度消失, 大小形状不同 的蛋白质在电场中别离.电泳结果的好坏肯定和电泳的条件有关 ,我认为应该注意以下几点 :1, 样品的纯度高
11、 ,杂质含量少 ,选择的 Loading 要正确;2, 就是胶的浓度要限制好 ,看你跑的条带大小来选择胶的浓度 ,特别是 别离胶的浓度 !3, 就是电压的选择 ,当样品在浓缩胶里时 ,可以把电压调小点 ,当到别离 胶时,电压可以加大 ,这样跑的条带就清楚 !4, 点样品的量要限制好 ,不能太多 ,否那么就跑成团状 ,也不能太少 ,条带 不清楚!至于样品和 Marker 显色问题 ,那要看你用的 Marker 是预染 Marker 还 是非预染Marker,如果用的是预染 Marker,那就是跑胶时,Marker条带 先显现出来！如果是非预染Marker,那条带就和样品一起染色时显现出 来!SD
12、S-PAGE经验集锦：极其好用2021-06-28 00:17蛋白SDS-PAGE电 泳及定量在蛋白质技术手册 5根底上,根据实验条件的方便修改. 请仔细看各种细节改进,各种操作效果经本实验室 5 年验证.【一】 储存液配制(注意配方和实际测定参数！ ！)(1) 2 M Tris-HCI (实测 pH 8.9 0.1, 25C) 500 mL: 121 g Tris base 加350 mL双蒸水溶解,以玻璃棒搅拌约1 min,缓慢参加浓盐酸(11.8 M)20 mL,继续搅拌均匀,并使Tris全部溶解,溶液澄清,参加适 量双蒸水至500 mL,倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱保存.(2) 10
13、0 g/L SDS 溶液： 10 g SDS (要求高纯度,其质量明显影响 电泳效果)加 100 mL 双蒸水,于洁净的 250 mL 烧杯中进行微波加 热溶解,注意不要爆沸,间歇用玻璃棒搅拌以加速溶解,完全溶解后的溶液应清澈透明无色.倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱保存.冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化.(3) 75% (v/v)甘油：于500 mL量筒中倒入分析纯甘油 300 mL,加双蒸水100 mL,以一次性塑料手套封口,颠倒量筒使甘油完全溶解,然后倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱保存.(4) 10 g/L溴酚蓝溶液：500 mg溴酚蓝加双蒸水50 mL,搅拌溶解, 倒入棕色玻璃试剂瓶
14、中,4 C冰箱保存.不用过滤.用时注意吸取上 层澄清液,不要吸到沉淀.【二】电泳工作液配制(省劲好用！ ！)(1) Acr-Bis液(丙烯酰胺溶液)500 mL:于800 mL洁净的烧杯中, 依次称取双丙烯酰胺4 g,丙烯酰胺146 g,缓慢倒入双蒸水约350 mL, 以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解. 注意,双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中, 所以要称重时注意周围空气流速, 称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双 丙烯酰胺掩盖.玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺 浮起并扩散到空气中. 完全溶解的溶液应清澈无色透明. 待溶解完全 后补加双蒸水至500 mL,倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱可保存10 个
15、月.(2) 4X别离胶缓冲液,500 mL :于500 mL洁净的量筒中,依次加入 375 mL 2 M Tris-HCI (实测 pH 8.9 0.1, 25C),100 g/L SDS 溶液(冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化)20 mL,最后参加适量双蒸水至500 mL.倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱最少可保存12 个月.有时冰箱温度过低会使储存液混浊, 微波略微加热使其澄清后 即可使用.( 3) 100 g/L 过硫酸铵溶液 (ammonium persuIfate, AP)20 mL: 2g 过 硫酸铵加20 mL双蒸水,倒入无色塑料试剂瓶中,4C冰箱最少可保 存10个月.注意配胶
16、时不要交叉污染 TEMED,可以以5 mL分装到 4 个无色塑料试剂瓶中分别保存.(4) TEMED 成品液: 购置后分装成 2 或 5 mL 小管装使用可预防母液受到污染.(5) 5X样品缓冲液,100 mL:依次参加50 mL 75% (v/v)甘油,20 mL 100 g/L SDS 溶液, 10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液, 5 mL 2 M Tris-HCI (实测 pH8.9士 0.1, 25C), 5 mL 巯基乙醇,9 mL 双蒸水. 混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中,4C冰箱至少可保存12个月.可分 装成 10 mL 使用,不会使母液受到蛋白污染.(6) 10X 电泳缓冲液,1000 mL:
