遗传病基因治疗

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1、遗传病基因治疗、遗传病基因治疗技术的原理1. 基因治疗是把具有正常功能的基因，通过特殊的基因载体（如病毒）或机械性方法 （如微量注射），引入患某种遗传病的患者细胞内，达到根治遗传病的目 的。基因治疗可以分为两类，一是体细胞基因治疗二是生殖细胞基因 治疗。前者较易于进行，后者则技术上较为复杂，并且关系到伦理问题， 目前基本没有在人体上进行。2. 基因治疗的基本要求1）在试验动物中证明所插入的基因能正确进入靶细胞中2）插入的基因能够存留在靶细胞中并且发挥作用3）基因表达的水平适当，并且受机体控制4）对细胞无损害1. 在70年代初，科学家们提出所谓的治疗由缺陷基因引起的遗传性疾病“基因手术”。2.

2、1990年9月14日，四岁的Deserve患有一种罕见的遗传性疾病称为严 重联合免疫缺陷病（SCID），成为在美国第一位接受基因治疗的人。由于 Deserve不能产生腺苷脱氨酶（ADA），因此没有一个健康的免疫系统， 这使她非常容易受到严重威胁生命的感染。医生从她的身体中取出白血 细胞，让细胞在实验室中生长，插入缺失的基因，然后注入患者的血液 中。实验室测试表明，该疗法能够加强Deserve的免疫系统。3. 第一个批准基因治疗的过程中充满着争议。人类基因治疗是非常复杂的， 有许多技术仍然需要开发和实验。公众以及政策对于人体基因工程材料 的可能用途的辩论也是同样的复杂。三、遗传病基因治疗技术发展

3、历史1. 基因治疗的发展划分为3个历史阶段1）准备期间（19801989年）这是基因治疗的“禁锢时代”。20世纪80年代初，从学术界到宗教、伦理、 法律各界，对基因治疗能否进入临床存在争议很大。直到1989年，美国联邦 食品与药品管理局（FDA）才同意将载体导入作为“基因标记”的临床试验， 1990年才正式批准其临床试验。在此期间，科学家们进行了大量的研究工作， 同时也在舆论上做了很多准备工作。2）狂热期（19901995年）1990年9月，美国国立卫生研究院的Anderson和Base将腺苷酸脱氨酶（ADA） 基因用反转录病毒导入人自身T淋巴细胞，经体外扩增后输回患者体内，成 功治愈一位由于

4、ADA基因缺陷导致严重免疫异常的4岁女孩。自此，基因治 疗的内容也由单基因遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系 统疾病、自身免疫疾病和内分泌疾病等。在短短数年内，美国就有100多个临 床方案经FDA批准进入临床试验。科学家在前10年所作的储备在这时几乎倾 巢而出，其中一些还没有成熟到可以取得疗效的方案也过早地进入了临床试 验。3）理性期（1996年至今）随着一位18岁的美国青年在美国宾夕法尼亚大学人类基因治疗中心接受治 疗时不幸死亡，成为被报道的首例死于基因治疗的患者。基因治疗从狂热转入 理性化的正常轨道，人们开始对基因治疗的前景进行冷静的思考与反思，基因 治疗的研究与发展也遇到

5、了前所末有的压力与挑战。四、遗传病基因治疗技术现状许多人赞同的体细胞疗法，但毫不犹豫地怀疑允许种系基因疗法可能会带来对未来 不可预见的影响。也有人认为，经过适当的调控和保障，种系基因疗法是一种迄今 取得的进展逻辑的延伸，道德上可以接受的程序。1. 体细胞疗法1）基因诊断指查出致病基因或与疾病密切有关的基因，可通过基因产物的检测来实现。所用方 法还有基因探针、限制酶酶谱分析、基因体外扩增（即多聚酶链反应，简写作PCR） 等多种技术。2）靶细胞选择转基因治疗中的靶细胞选用应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力 的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细 胞、前

6、体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以目前的观点看，骨髓细胞是唯一满 足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟； 另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞（如单核巨噬细胞）的前体。因此，不仅 一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症（即前文提到的严重联合免疫缺陷病SCID）、 珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等的基因治疗都以骨髓细胞作为靶细 胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也以此作为靶细胞。 除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实 施转基因治疗。3）载体选择目前用于转基因的载体有许多，最常用的有质粒、病毒

7、载体。在选择载体时，需要 考虑的是载体对机体的毒性、载体所携带的转录启动子启动转录的效率、载体对靶 细胞的转染效率等。为了能够携带一些较大的基因（如DNA基因），近年来也探索了 一些用较大的质粒（如人工酵母染色体-YAC）来实现大片段基因的转染。4）目的基因的表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用基因扩增等方法适当提高外 源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信 号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。5）转基因过程中注意事项a）必须考虑到被转基因在靶细胞中具有适当的表达效率。尽管在某些遗传 病，正常基因2% 5%的表达量就

8、可能不会发病，但像珠蛋白生成障碍 性贫血等疾病则需要较高的表达水平。b）被转基因的表达必须受到严格的调控，做到这一点虽然很难，但在某些疾 病，过少的基因表达不能达到治疗目的，而过多的表达又会引起不良反应， 因此，这就需要严格的体外试验和动物试验。c）大片段基因的转染以及不分裂细胞的转染都需要特别的考虑，否则难以达 到预期效果。2. 种系基因治疗种系基因治疗不仅在技术上更困难，而且也提出了更多的道德挑战。种系基因治疗 的主要方法有：1）治疗前对严重的基因缺陷的母亲进行了胚胎植入（需要在体外授精技术的使 用）2）直接治疗病患成人的生殖细胞（精子或卵子细胞）的遗传缺陷，使缺陷基因不 会被传递到他们的

9、后代。这种方法需要的技术专长，删除有缺陷的基因，插 入正常基因。3. 人类疾病基因治疗候选人的标准1）疾病是无法治愈的，并且受该疾病影响威胁生命2）其作用器官、组织和细胞类型已经确定3）对应有缺陷的基因的正常基因已被分离和克隆4）基因可充分表达（生产足够的蛋白质）5）技术上可验证程序是安全的4. 当前的基因治疗研究中的急需解决的问题1）提供更多可供利用的基因：目前有治疗价值的基因不多。以恶性肿瘤为例，能抑制肿瘤生长的基因为数不 多；遗传病中多基因疾病的基因尚不清楚。因此，难以达到治疗目的。2）设计定向整合的载体:基因治疗的基因导入手段要求是高效导入，而且能定向地导人体内某种细胞。 已有手段均低

10、效和无导向性。即使导入的基因有治病效果，但由于不能有效地 导入，效果也会大受影响。3）如何高效持续表达导入基因：导入基因现有的表达量不高，如血友病B的基因治疗，凝血因子9的表达量 只有正常人的5 %，若能达到10 %，则治疗效果会大大提高。4）导入的基因做乏可控性：目前可以做到导入一个胰岛素基因在体内分泌胰岛素，但是如果导入的胰岛素 基因分泌胰岛素而不受机体内血糖浓度和激素的调控，后果将会非常严重。因 此，急需解决如何对导入基因的表达实现可控调节。5）靶细胞的类型的选择和细胞移植技术6）更有效的动物模型：获得性和遗传性疾病的基因治疗，都需要更有效的动物模型。7）基因转移中的副作用和抗体形成问题

11、以上任何一个环节的阻碍，都将造成基因治疗研究的停滞甚至后退，因 此我们要对困难有充分的估计，对科研工作的艰巨性、复杂性有全面的 认识，才能处乱不惊，乐观地面对种种困难和挑战，取得科研工作中的 进步与提高。5. 全球基因治疗临床试验情况自从1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验以来，世界各国都掀起了 基因治疗的研究热潮。截止到1995年，全世界共有100多个基因治疗临床方案， 但在美国NIH主持的评估中发现真正有效的方案仅为几个，从而提出必须加强基因 治疗中的关键基础问题的研究，加强了对基因治疗临床试验方案的审批和监管力 度。从此，基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道，并一直稳健发展。

12、据统计，截 至2004年6月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有987个，表明基因 治疗具有良好的发展前景。在所有的临床试验方案中1）恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案的首位，占总数的66%；2）心血管疾病占全部基因治疗临床试验方案的8.1%；3）单基因疾病占全部基因治疗临床试验方案的9.4%；4）感染性疾病，主要是艾滋病（AIDS）占全部基因治疗临床试验方案的6.6%；5）其他疾病占全部基因治疗临床试验方案的2.9%；6）基因示踪占全部基因治疗临床试验方案的5.3%。目前这些基因治疗临床方案 大多数处于1/II期临床试验阶段，其中I期临床方案有624个，I/II期204 个，11期13

13、1个，I/ III期11个，III期17个。目前只有我国的重组腺病毒 p53抗癌注射液（商品名“今又生”）作为世界上第一个基因治疗产品正 式上市，这不仅标志着我国能够在“点”上取得世界性的科技突破，也意味着 我国有能力在生物高技术产业化进程中抢占先机；7）总的来说，在基因治疗基础研究和临床试验及产业化各个领域，美国均领先于 世界，其临床方案有662个，占世界上总数的67%。8）但是也存在一些有效性和安全性的问题，例如：a）目前进入1期临床试验的只有17个，而且大多数临床试验疗效有限；b）法国巴黎Necker儿童医院因SCID接受基因治疗的患者中有三名出现了类 白血病样症状，表明基因治疗安全性问

14、题有待于进一步解决。五、遗传病基因治疗技术的发展趋势基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性 疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基 因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很 大的进步。实际上，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主 要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向 性地导入到特异的细胞。在过去的40年，基因疗法已经为诸如癌症、心血管疾病、人类免疫缺陷 病毒（HIV）、血友病隐性单基因疾病等许多疾病的进行了临床研究。迄 今为止，在28个国家已有超过1,340基因治疗临床试验完成、正在进行 或

15、已获得批准，使用超过100个基因。这些（66.5% ）的临床试验大多 是针对癌症的治疗。1.基因治疗面临的问题和挑战基因治疗的发展经历了 “乐观与热情一失望与怀疑一理性与挑战”的过 程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要瓶颈在 于有效性和安全性。基因治疗领域的关键问题，其核心问题在于基因治 疗的靶向性，目前全世界范围内的科学家都在不同层面上对这些问题进 行深入研究。主要表现为：1）基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。如以腺病毒为载体的p53 基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局 部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织 的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。前面提到的第一例 逆转录病毒介导ADA基因转移成功治疗SCID的病例，因为导入效 率较低，前后经历了 11次体外转导和回输。2）逆转录病毒载体的局限性。目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大 多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的， 有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。而理想的基因治疗方 案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入 到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。3）表达方式和表达水平的局限性。理想的基因治疗应能根据病变的性 质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的 水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，