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1、益生菌在常规培养条件下连续传代1000 代过程中稳定性研究摘 要：以益生菌 Lactobacillus casei Zhang 为研究对象，通过观察该菌株在普通 MRS 培养 基中连续传代1 000代期间细胞 形态 、菌落形态 、活菌数、浊度和菌株活力的变化对其稳 定性进行了初步评价。结果表明，L.casei Zhang在1000代期间细胞形态与菌落形态没有发 生变化；活菌数、浊度均和菌株活力随培养代数的增加呈现波动性变化，但波动幅度较小， 总数基本维持不变。上述研究结果初步表明L. caseiZhang具有良好的稳定性，暗示其可用 于产业化生产。关键词：益生菌；Lactobacillus c
2、asei Zhang；连续传代；稳定性Study on the stability of the probiotic Lactobacillus casei Zhang during continuous subculturing in normal condition for 1000 generationsAbstract: In this study, we selected probiotic Lactobacillus casei Zhang as the research object, and its stability was assessed by monitoring th
3、e change of cell morphology, colony morphology, viable counts, growth (OD600) and activity during the 1 000 generations. The results showedthat bacterial cell and colony morphology of L. casei Zhang had no change, and the viable counts, growth and bacterial activity of L. caseiZhang fluctuated mildl
4、y. In a word, L. casei Zhang was stable during long-term contiuous subculturing, which can be further applied in industry.Key words: Probiotic; L. casei Zhang; Continuous Subculturing; Stability116Vol.41， No.11 2013(total 276)Research Papers研究报告0引言 益生菌是指通过摄入适当量从而对宿主产生有 益作用的活性微生物， 对人体主要具有免疫调节、调 整肠道菌群
5、、防止腹泻、降低粪便中某些酶活性及抗 突变抗癌的医疗保健作用1-4。 通常益生菌都要经过严格的筛选，还要经过动物实验和人体临床实验的综合 评价5-6。 此外，它们还应具备优良的遗传稳定性能7 o 从微生物应用的角度来看，这也是菌株实现产业化生 产的必备条件。益生菌 Lactobacillus casei Zhang 来源于草原蒙古族 几前年流传下来的原生态发酵乳饮料酸马奶8。 经过 多年系统的基础研究，我们自主解决了其产业化的关 键技术问题。本文通过观察该菌株在普通MRS培养基 中连续传代1 000 代期间细胞形态、活菌数、浊度和菌 株活力的变化对其稳定性进行了评价，以期为后续试 验提供参考。
6、1 实验1.1 材料1.1.1 菌株来源益生菌 L. casei Zhang 原始菌株（0 代）是由内蒙古 农业大学提供，LABCC编号IMAU10048。1.1.2 试剂与仪器试剂：法国梅里埃合成无糖MRS培养基，纽西兰 超特级脱脂乳粉，葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、琼 脂粉等常用试剂均为国产分析纯试剂。仪器：NSC-IIA-1200无菌工作台，恒温培养箱（LRH -500F）， 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 （Eppendorf5810R型）,pH计（SJ-3F型）,超纯水系统（MUL- 9000），HITACHI U-2000 型紫外可见分光光度计 ， HIRAYAMA HA-3
7、00M全自动高压灭菌 器等。1.2 实验菌株的连续传代培养及培养代数计算 将0代益生菌L. casei Zhang按体积分数为1%接种 量进行长期连续传代培养至 1 000 代。 在每个传代周 期（24 h）内，菌体菌数约增长100倍，生长代数约为 6.64 代9。1.3细胞形态学观察在菌株 L. casei Zhang 连续传代过程中，培养至1 000 代时对菌株进行革兰氏染色、油镜观察、照相， 观察培养周期末菌株细胞形态。1.3 生长周期末活菌数变化在菌株传代过程中，每培养200代测定各个菌株在培养周期末（24 h）的活菌数。样品经倍比稀释到合 适梯度后，采用MRS固体培养基平皿倾注法，3
8、7 C厌 氧培养72 h后计菌落总数，选取菌落数在30300之间 的平板作为活菌总数测定的指标。1.5生长周期末浊度变化 在菌株传代过程中，每培养200代测定连续3天的 培养周期末的培养液浊度。传代培养液用未接菌培养 基适当稀释，采用比浊法于600 nm处测定其浊度。1.6菌株活力的测定在菌株传代过程中，每培养200代测定各个菌株的菌体产酸活力。各菌株以1 X107mL-1接种于10 mL灭菌脱脂乳中，37 C恒温培养24 h，取出后立即放入冰 浴，每样加30 mL蒸馏水稀释后，以酚酞作指示剂，以 浓度为0.1 mol/L的NaOH滴定至微红色30 s不退色为 止，记录消耗NaOH的体积以计算
9、出样品中的乳酸浓 度，再换算为活力单位。1.7数据处理采用DPS软件对数据进行方差分析，各项指标均 做3个平行。2结果与分析2.1细胞形态学观察 形态学观察是微生物研究最基本的方法。 L. caseiZhang 0代和1 000代显微镜照相照片如图1所示。由图 1可以看出，L. casei Zhang原始菌株细胞典型形态为呈 对或呈链杆状排列。在MRS培养基中连续传代以后， 1000代菌株细胞形态没有发生大的变化，与原始菌株 形态基本保持一致。这也许可以说明在常规培养条件 下连续传代培养对细胞形态影响微乎其微。2.3生长周期末活菌数长期传代过程中接种量维持恒定不变，因此生长 周期末活菌数也可以
10、认为是衡量菌株稳定性的窗口。L. casei Zhang在连续培养1000代期间，不同代数菌株 在培养周期末的活菌数变化情况如表1所示。由表1可 以看出，在普通MRS培养基中其活菌数在传代过程中 变化差异显著（P0.05）,但没有随培养代数的增加呈 规律性的单调递增或单调递减趋势。 事实上， 3 个平行 菌落间在最初开始培养时活菌数就有差异（P0.05）, 但这些差异并没有随培养代数的增加而发生变化。菌 落1和菌落2在200代和400代期间也曾出现活菌数相同 的情况。 总体来看，在连续培养传代过程中 3 个独立菌 落的活菌数与菌株培养代数间并无明显线性关系，基 本稳定在一个固定区间内。2.4
11、生长周期末浊度 在连续培养 1 000 代过程中， L. casei Zhang 各菌株 在培养周期末的 OD600值变化情况如表2 所示。由表2可 以看出， L. casei Zhang 在连续传代过程中 OD600值变化差异显著（P0.05）。与生长周期末活菌数统计分析结 果类似， OD600值总体维持在一定范围内并且和培养代 数间没有明显的线性关系。表1在连续培养0 1000代期间活菌数（对数值）变化mL-1培养代数0代200 代400 代600 代800 代1000代L. casei Zhang-1+8.840.11y,c9.210.03y,a9.230.05y,a9.050.03y,
12、b9.080.05y,b9.270.03y,aL. casei Zhang-2+9.180.09x,b9.210.01y,b9.370.05x,a9.060.09y,c9.190.01x,b9.130.06z,bcL. casei Zhang-3+9.050.04x,c9.430.10x,a9.340.06x,ab9.280.03x,b9.150.05x,c9.370.04x,ab注：上角+为在普通MRS培养基中培养。不同字母的上角数据之间差 异显著（P0.05）,其中字母abcde代表列数据分析，xyz代表行数据 分析，下同。图益生菌L. casei Zhang 传代期间细胞形态对比L. c
13、asei Zhang-1+0 L. casei Zhang-2+0L. casei Zhang-3+0 L. casei Zhang-1+1000L. casei Zhang-2+1000 L. casei Zhang-3+1000172013 年第 41 卷第 11 期(总第 276 期)2.5 菌种活力评价 在连续传代培养 1 000 代过程中， 菌株的产酸活 力测定结果如表3所示。由表3可以看出，L. casei Zhang 在传代培养过程中产酸活力可以很好的维持在一定 范围内，侧面反映该菌株经过多次传代后仍然可以保 持筛选之初的基本特性。3讨论本文对益生菌L. casei Zhang传
14、代1 000代期间的 表型特征稳定性进行了研究，结果初步表明该菌株在 普通MRS培养基中连续传代1 000代期间细胞形态、 活菌数、浊度和菌株活力的变化均不显著，暗示其在 产业化流通过程中具有良好的稳定性。类似地， 周朝晖等利用 RAPD 标记技术和高效液 相色谱指纹图谱对昂立植物乳杆菌连续传代15代以 后的稳定性进行了检测10。 与此相反，刘衍芬等利用RAPD标记技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS- PAGE) 技术对直投式发酵剂中分离出的乳酸菌传代 次数和保存方法进行了探讨1
15、1-12，结果表明乳杆菌在 传代过程中连续转管次数不同时基因组和蛋白质均有变化。刘晓辉等于2008年研究了乳酸菌Q26菌株传 代过程中转管不同次数时的形态变化和蛋白差异， 结果发现受试菌株在第40代时蛋白表达开始发生变化13。 这些研究为揭示益生乳酸菌传代过程中变异产 生的分子机理奠定了基础，也用数据证明遗传稳定性 在产业化生产过程中不容忽视的地位。 与此同时，这 些研究结果也说明关于益生菌稳定性的研究有待于 进一步深入。参考文献1 SUDARSHAN R, SREE VIJAYABALA G, RAJKS D. Probiotics the Promising Future-A review J. Journal of Case Report and Review, 2013, 2(1): 98-105.2 TUO Y, ZHANG Q, CHU F, et al. Immunological Evaluation of Lactobaci
