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1、琼脂糖凝胶电泳1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛 ”和 “电泳 ”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构， 物质分子通过时会受到阻力， 大分子物质在涌动时受到的阻力大， 因此在凝胶电泳中， 带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小， 这就大大提高了分辨能力。 但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH 不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的 pH 在 69 之间，离子强度 0.
2、020.05 为最适。常用 1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差 100bp 的 DNA 片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离 DNA 的范围为 0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达 107bp 的 DNA 片段。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。 由于糖 -磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2 操作流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意 D
3、NA 酶污染的仪器可能会降解 DNA ，造成条带信号弱、 模糊甚至缺失的现象。(1)电泳方法1一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大 DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA 链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。(2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳， 浓度通常在 0.5 2% 之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳， 高浓度的用来进行小片段分析。 低浓度胶易碎， 小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨，造成条带缺失现象。(3)缓冲
4、液常用的缓冲液有 TAE 和 TBE，而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。 注意电泳缓冲液多次使用后， 离子强度降低， pH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。三羟甲基氨基甲烷（ Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为 Tris）是一种有机化合物， 其分子式为 (HOCH2)3CNH2 。Tris 被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。 例如，在生物化学实验中常用的 TAE 和 TBE缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。(4)电压
5、和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30，对于巨大的 DNA电泳，温度应该低于15。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象(5)DNA 样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA 样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA 条带迁移。在上样前不要对DNA 样品加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释可以防止DNA 变性。(6)DNA 的上样2正确的 DNA 上样量是条带清晰
6、的保证。注意太多的 DNA 上样量可能导致 DNA 带型模糊，而太小的 DNA 上样量则导致带信号弱甚至缺失。(7)Marker 的选择DNA 电泳一定要使用DNA Marker 或已知大小的正对照DNA 来估计 DNA片段大小。 Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。需要注意的是 Marker 的电泳同样也要符合 DNA 电泳的操作标准。如果选择 DNA/HindIII 或者 DNA/EcoRI的酶切 Marker ，需要预先 65加热 5min ，冰上冷却后使用。从而避免 HindIII 或 EcoRI 酶切造成的粘性接头导致的片
7、段连接不规则或条带信号弱等现象。(8)凝胶的染色和观察实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（ EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。3 回收编辑(1)DNA 片段的胶回收方法电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)胶回收注意事项a.将电泳槽用 ddH2O 反复清洗干净，倒入新鲜配制的灭菌电泳缓冲液；3b.根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；c.切胶时尽可能切掉不含DNA 片段的凝胶；d.要尽量减少 DNA 在紫外下的照射时间以减少对DNA 的
8、损伤；e.熔胶要完全。loading bufferloading buffer 的中文名字叫上样缓冲液，6* 的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫兰色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、 1.4%和 2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb 和 0.15Kb 的双链线性 DNA 片段大致相同；后面的兰色条带是二甲苯青，它在1%和 1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与 2Kb 和 1.6Kb 的双链线性 DNA 大致相似。而对于 PAGE 胶他们的迁移速率也分别不同。1.主要用途loading buffer 的功能主要有两个：第一，里边的指示剂 溴酚蓝和二甲苯青
9、FF 起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度 ，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的 Buffer 是加有 SDS 的，一般都会写明。 SDS 主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA 双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液， 加 loading 100加热， 也是为了中止酶促反应， 防止提取的蛋白质降解。2.制备方法loading buffer 一般配置：(1) 6 Loading buffer:30mM EDTA36%(v/v) Glycerol0.05%(w/v) Xylene C
10、yanol FF0.05%(w/v) Bromophenol Blue主要用于 DNA 电泳4(2) 10 Loading buffer:30mM EDTA50%(v/v) Glycerol0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF0.25%(w/v) Bromophenol Blue主要用于 RNA 电泳注：（1）10loading buffer 中仅有色素溴酚蓝（ Bromophenol Blue)一种染料（浓度 0.05%）；（2）6loading buffer 中含色素溴酚蓝（ Bromophenol Blue)、二甲苯青蓝 FF（ Xylene Cyanol FF)两种染
11、料（浓度都是 0.05%）在琼脂糖凝胶（ 0.5% 1.4%）中溴酚蓝（ Bromophenol Blue）约与 300 bp的双链线状 DNA 的迁移速度相同，二甲苯腈蓝FF 则与 4 kbp 的双链线状 DNA的迁移速度相等。6loading buffer 是用来上样的； 10loading buffer 是 stop buffer，是停止酶促反应的 ，如果一定要用 10loading buffer 的上样当然也可以，唯一要注意的是： 10loading buffer 中多了一样 SDS，它会使酶类如 taq 酶变性 ，以 PCR 产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散， 如果电泳跑的距离短
12、， 和多出来一条带没有什么区别（大概 1000bp 左右）。(3) 5 SDS-PAGE Loading Buffer 配制方法组份浓度：250mM Tris-HCl （ pH6.8）10%（W/V ） SDS0.5%（W/V ） BPB50%（V/V ） 甘油5%（W/V ） -巯基乙醇配制量：5mL配制方法：51.量取下列试剂，置于10mL 塑料离心管中。1M Tris-HCl1.25mLSDS（ 十二烷基硫酸钠） 0.5gBPB（溴酚蓝）25mg甘油2.5mL2.加入去离子水溶解后定容至5mL。3.小份（ 500 l/份）分装后，于室温保存。4.使用前将 25l的 2-ME 加到每小份中
13、。5.加入 2-ME 的 Loading Buffer 可在室温下保存一个月左右16S 核糖体 RNA1.简介16S 核糖体 RNA（ 16S ribosomal RNA，或简称为 16S rRNA）是1 分。 16S rRNA 的长度约为 1,542 nt。一个细菌的细胞中可包含多种具有不同序列的 16S rRNA已知 16S rRNA 具有如下几项功能：16S rRNA 具有与原核生物核糖体大亚基中的23S rRNA 相似的结构决定功能，可作为核糖体蛋白质结合的架构。在足量Mg2+存在下分离到的16S rRNA处于紧密状态，其空间结构与30S 亚基的大小和形状十分相似。16S rRNA 的 3端含有能与 mRNA 上游 AUG 起始密码子通过氢键结合的反夏因 -达尔加诺序列。另有发现表明，16S rRNA 中 1,5051,539 的 CCUCC 序列与 mRNA 的相应序列有互补关系。16S rRNA 能通过氢键与 23S rRNA 结合，增强原核生物70S 核糖体一大一小两个亚基（ 50S 亚基与 30S 亚基）结合时的稳定性。16S rRNA 能通过其 1,492 及 1,493 的腺嘌呤残基（参见嘌呤分子结构图解）的 N1 原子与 mRNA 骨架上的 2OH 基团之间产生氢键， 使核糖体 A 位密码子反密码子的碱基互补配对稳定化。
