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1、省科技攻关计划项目可行性研究报告一、立项的背景和意义二十一世纪的生命科学将是基因科学,随着人类基因组图谱的全部破译，基因治疗肿瘤将使医学科学进入一个崭新的时代。基因治疗技术研究的迅速发展，IL-24在肿瘤治疗方面将会是一座新的里程碑。基因治疗恶性实体肿瘤是临床医生面临的挑战性课题，由于肿瘤易转移的特性，使手术、化疗和放疗等传统治疗方法对晚期肿瘤的治疗有限。研究表明，肿瘤生长的关键因素是血管形成，实体瘤表达，如血管生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板源性生长因子等血管形成介导肿瘤产生新血管，利用原发肿瘤的血管的形成而转移。因此，寻找抑制肿瘤生长和血管形成进而阻止肿瘤转移的方法尤为重要，基因疗法
2、为恶性实体肿瘤的治疗提供了这种可能性。理想的功能基因表达产物应能诱导肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成，对正常组织细胞无明显毒副作用。白细胞介素-24（IL-24）具有上述功能。目前,利用白细胞介素-24（IL-24）对恶性肿瘤的基因治疗,是发达国家的研究热点之一。白细胞介素-24（IL-24）是1995年Jiang H等人首先克隆并分离出该细胞因子，原名称黑色瘤分化相关抗原（mda7），XX年，mda7因其分子结构、基因定位和细胞因子样特性而被正式命名为白细胞介素24（IL-24）。研究表明，借助腺病毒表达载体，将人白细胞介素24基因转染肿瘤细胞，可特异性抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡，
3、但不会影响正常细胞。IL-24的这种作用在至少50余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证实，包括黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。可以认为IL-24是目前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的蛋白基因。目前，P53、P10、Rb等抑癌基因正在用于基因治疗的临床试验（其中重组人P53腺病毒注射液已在我国生产上市，也是世界上第一个上市的基因治疗药物），但均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性。所以，通过比较可以证明IL-24的研究有着重要的临床意义。通过腺病毒介导人IL-24基因进行治疗肿瘤的基因治疗的技术，具有非常重要的社会
4、、理论和临床意义。基因治疗产品使细胞产生内源性的目的蛋白质或多肽，产生特异的生物治疗。基因治疗使给药更加特异、高效和安全，达到医学科学所期望达到的最高目标。基因治疗药物将对基因工程蛋白质或者肽类药物也形成严重的挑战，用基因治疗方法可代替反复使用、费用极高的蛋白质药物，一次注射，可带来长久的疗效或根治。据世界卫生组织（WHO）统计，全世界每年有500多万人死于各种癌症，每年各种癌症患者多达2200万人。我国每年约有600万肿瘤患者，假如有百分之一的患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，治疗一个疗程，用药20支，其用量为120万支，按每支XX元人民币计算，国内市场为24亿元人民币，国内外
5、市场的百分之一为44亿元人民币。所以，基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量的高科技项目。该项目是我单位独立研究的基因治疗项目，现已独立完成了人白细胞介素24基因的克隆。从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素24的基因，经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致，说明我们已得到人IL-24的基因。正进行重组腺病毒载体的构建。本单位是生物医药研究、开发、生产、经营的专业化企业，是山东省高新技术企业，十余年来承担了多个项目的研究。独立研究的IL-2（125ser）是山东省火炬计划项目、IL-18是XX年山东省重大科技攻关项目、G-CSF 是济南市星火计划项目、-2b干扰素抗病
6、毒口含片是XX年山东省SARS综合防治技术研究药物开发中标项目、重组人新型溶栓酶是XX年济南市科技发展计划项目，其中IL-2（125ser）获省、市、区科技进步奖，并获国家科技部等五部委联合颁发的国家重点新产品证书。有较强的生物技术药物研究开发能力。该项目的成功开发及产业化，势必将带动我国整个生物高新技术的发展，并构成一个生物高技术平台，一个巨大的产业，一个新的经济增长点。同时,不仅能够在临床上有着重要的治疗意义，而且能够对广大肿瘤患者提供一条崭新的治疗途径，也将会对生命科学的发展和山东省经济的发展起到一定的作用。二、国内外现状和发展趋势：经检索，在国内，只检索到军事医学科学院和苏州大学细胞和
7、分子生物学教研室对IL24基因的克隆及在大肠杆菌中的表达文献，未发现利用腺病毒介导人IL-24基因来治疗肿瘤的报道。也未发现利用Admax腺病毒表达系统来介导人白细胞介素24基因治疗肿瘤的专利。所以，我单位研制的重组人白细胞介素-24腺病毒注射液可形成自己的知识产权。在国外，只有美国等少数发达国家对携带IL-24基因的重组腺病毒进行研究，尚未有对其开发成药物的报道。目前国内未发现有对IL-24进行药物研究的单位和个人。我单位从上世纪八十年代中期开始对生物技术进行研究，基本与国外同行业同步。已独立研制成功了IL-2（125ser）、IL-18、G-CSF、-2b干扰素抗病毒口含片、重组人新型溶栓
8、酶等生物技术高科技成果产品。拥有一支素质较高、经验丰富的科研队伍。已对该项目进行了一年多的研究，已完成人白细胞介素24基因的克隆。从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素24的基因，经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致，证明我们已得到人IL-24的基因。正进行重组腺病毒载体的构建。基因治疗的关键技术是表达系统，腺病毒表达系统被广泛用于基因治疗、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发等领域。我单位利用Admax腺病毒表达系统来介导人白细胞介素24基因治疗肿瘤，Admax腺病毒载体系统比现有的其它腺病毒载体系统更有优势，具有构建简单、出毒快、单细胞病毒产量高等优点。三、现有研究基础、
9、特色和优势1、 现阶段已达到的主要技术指标和经济指标（1）现阶段已完成人白细胞介素24基因的克隆。（2）从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素24的基因，经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致，说明我们已得到人IL-24的基因。（3）正进行重组腺病毒载体的构建。2、 项目的创新点及在人才、资源和产业方面的特色优势重组人白细胞介素-24腺病毒主要创新点：（1）、 白细胞介素24是新发现的抗肿瘤细胞因子，国内外均未上市。（2）、 利用Admax腺病毒作载体将IL-24基因介导到人体，对肿瘤细胞进行基因治疗的方法。腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人
10、类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。因此，腺病毒载体系统具有靶向性，使其可以靶向特定的组织或细胞内复制增殖，表达目的基因，直接作用于病灶，抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡。（3）、 Admax腺病毒表达载体具有构建简单，出毒快，单细胞病毒产量高等特点 。Admax腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr. Frank G
11、raham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒（腺病毒基因组质粒）在重组酶的作用下产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺型腺病毒。与目前使用最普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要24周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34%（Stratagene公司新版的AdEasy
12、XL系统成功率在94%左右），且在原核细胞（BJ5183）中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。人才、资源和产业方面的特色优势：本单位是山东省科技厅认定的高新技术企业及重点联系单位。在人才、资源和产业化方面具备如下优势：1、有研究开发基因药物的专业机构-生物技术研究所。配备有较完善的科研生产检测仪器和设备（DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、Waters的高效液相、万级净化级别的实验室等）。2、拥有一支经验丰富、老中青相结合的科研队伍。已开发出的国家级新药“重组人白细胞介素-2（125s
13、er）”和“重组人粒细胞集落刺激因子”，并已获得国家药品监督管理局颁发的新药证书和批准文号，现已投放市场。3、有一座4000m2的GMP标准的生物药品生产车间（GMP证书编号：C1064），年生产药品能力可达千万支。4、有完善的科研协作网络。我单位与“美国俄亥俄州立大学分子生物学中心”、“中国协和医科大学”、“山东大学药学院”等国内外大专院校和科研院所有紧密合作关系。本项目是与中国协和医科大学共同合作研究的科研项目。5、我单位科研工作经验丰富，承担过省、市、区级科研项目多项。上述条件，为“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”的研制奠定了基础。四、应用或产业化前景、市场需求人白细胞介素-24（I
14、L-24）是目前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的具有双重功效的蛋白基因。研究表明，借助腺病毒表达载体，将人白细胞介素24基因转染肿瘤细胞，可特异性抑制肿瘤细胞生长，诱导其调亡，但不会影响正常细胞。IL-24的这种作用在至少50余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证实，包括黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。全世界每年有500多万人死于各种癌症，每年各种癌症患者多达2200万人。我国每年约有600万肿瘤患者，假如有百分之一的患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”，治疗一个疗程，用药20支，其用量为120万支，按每支XX
15、元人民币计算，国内市场为24亿元人民币，国内外市场的百分之一为44亿元人民币。该项目产业化后，可年产100万支，实现产值20亿元人民币，年销售收入可达12亿元人民币，年利税6亿元人民币，年创汇XX万美元。所以，基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量的高科技项目。同时，对包装、印刷、玻璃制品等行业起到带动作用。五、研究内容与预期目标研究内容：1、人白细胞介素-24基因的克隆2、重组人白细胞介素-24腺病毒的建立3、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法的建立4、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验总体目标本项目预计投入800万元人民币。可完成基础性研究，获得重组人白细胞介素-24腺病毒注射液样品，整理出科研文献。本单位现有资产 亿元人民币，员工116人。经济目标项目完成时，预计年新增产品销售额3000 万元、年新增交税总额200万元、年新增净利润 1000万元、年新增创（节）汇 200 万美元、年新增产值4000万元。技术、质量指标：参照国家人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则、中国生物制品规程、中国药典（XX年版）等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品的病毒纯度、病毒滴度的测定和复制型病毒（RCA）
