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1、实验一根系活性的测定1原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的 a-萘胺，生成红色的 a -羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。 根对 a -萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系， 日本 人相见、松中等人认为 a-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对 a -萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。a -萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定 a -奈胺含量。2药品:(1)(2)(3)(4)40ppm （ug/ml ）弘萘胺溶液：精确称取010g分析纯a -萘胺，先用2ml95%酒精溶保解
2、，加约50ml蒸馏水移入于低温暗处保存。用前稀释 1%对氨基苯磺酸溶液：称100ppm亚硝酸钠溶液：称100ml容量瓶中，然后稀释至刻度，存于棕色瓶中，置25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。1 g对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。010g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。0. 067mol/L pH70磷酸缓冲液分子量178.05N a2HPO4.2H2ON a2HPO4.12H2OKH 2PO4358.22N a2HPO4.2H2O1000ml容量瓶中。136.097.1184g (或 N0. 067mol PH70(1000ml磷酸缓冲液)所需量(g)7.
3、1184g14.4004g3.6292ga2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH 2PO4 3.6292g 定容到试管号1 （对照）23456a -萘胺(ml)1冰）11111磷酸缓冲液（ml）111111蒸馏水（ml）151515151515对氨基苯磺酸（ml）111111100ppm亚硝酸钠（ml）111111a-萘胺标准曲线的绘制3方法与步骤：（1） a -萘胺标准曲线的绘制：用40ppm a -萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm各浓度a -萘胺的配制：用40ppm溶液配制浓度5 ppm10ppm20ppm30ppm40ppm40ppm a -萘胺(ml)51
4、0203040蒸馏水353020100混匀，置室温（20 25度）下5分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml,摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为0,读取光密度，以a-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。（2）将待测根系吸净吸干附着水称取 1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的a -萘胺溶液和磷 酸缓冲液各25ml，混匀。静置5-10分钟后（根吸附以完毕），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在 25C 下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间， 定时的摇动），反应时间完毕后，再取 2mL 溶液放入
5、另一刻度试管， 因为 a -萘胺溶液会 自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根， a -萘胺 溶液的氧化量会意外增加） 。（4） 在上述两次及空白试验所吸取的 2ml 测定液中， 各加入 10ml 蒸馏水， 混匀后再加入 1% 对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml,混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入 蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出 a -萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为 准确 些）。（5）结果计算根系对 a -萘胺的生物氧化量 Y （ug.g-1.
6、h-1 ）按下式进行计算Y=（A-B） -（C-D） *E/ （t*W ）式中：A-第一次取液测定值（ugml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶 促反应；B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的a -萘胺浓度（ug.ml-1 ）。A-B 即 a -萘胺氧化总量；C-第一次空白测定值（ug.ml-1）；D-第二次空白测定值；C-D 即 a -萘胺自发氧化量；E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）；t-3 小时；w-样品鲜重（也可以用干重计算）；实验二、 硝酸还原酶活性的测定- 活体法原理:硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化
7、植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸 盐，产生 的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及 a -萘胺（或萘基乙烯胺）在 酸性条件下定量 生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ugg-1h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重 复性较 好。试剂1.亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO209857g溶于去离子水后定容至后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮lug.ml-1的标准液;1 000ml，然2.0.
8、1molpH7.5 的磷酸缓冲液 水溶解后定容至 1 000ml;Na2HPO4.12H2O30.0905g 与 NaH2PO4.2H2O 2.4965g 加去离 子3.1% （W/V ）溶液：10g对氨基苯磺酸溶于100ml 3 molL -1HCL中（25ml浓盐酸加水定 容至 100ml 即为 3 mol.L -1HCL ）；4.0. 02% （W/V ）萘基乙烯胺溶液：0. 020g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色 瓶中；5. 0.1mol.L-1KNO 3溶液：2.5275g KNO 3溶于 250Ml 0.1mol 丄-1Ph7.5 的磷酸缓冲液中；6. 0. 025m
9、ol.L -1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8. 864 0g Na2HP04.12H20, 0. 0570g KH 2OP4.3H20,溶 于 1 000ml去离子水中；100ml。7. 30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至方法1. 标准曲线制作:管号亚硝酸钠标准液试剂蒸馏水（ml）1%磺胺0.02%萘基乙烯胺每管含亚硝态氮（ug）123456700.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.01.8 1.6 摇匀后在25度下保温30min,然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X）,吸光值为 纵坐标（Y建立 回归方程。2. 样 品 中 硝 酸 还 原 酶
10、活 力 测 定 在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 称取作物叶片0.5g （共3份，剪成1cm左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中1份作 对照，另外2份作酶活性测定用。 反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml0. 1mol/L KNO溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25C黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。 比色测定：将各瓶摇匀静置 2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再
11、加入1ml萘基乙烯胺，再在35C水浴中显色15min,后比色，540nm. 0.8 0.4 0.04444444444444400.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.015min。5.空白溶液：2ml蒸憾水+1m 1磺胺+lmla -蔡胺。同样和样液一样进行水浴、结果计算单位鲜重样品中硝酸还原酶活性卩 g/ （g .h）式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，卩g ; Vi为提取酶时加入的缓冲液体积,ml; v2为酶反应时加人的粗酶液体积，ml; W为样品鲜重，g； t为反应时间，ho实验三外渗电导法方法：1. 清洗用具：三角瓶一定要清洗干净。2. 取样与浸泡，最好用完整叶和根，以消除伤
12、口的影响，用天平准确称取一定量的材料（如0. 1-10g）对应放入已编号的三角瓶中，加入一定量的去离子水浸泡，自然浸泡2小时,可在震荡器上震荡，注意：各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般应在室温条件下进 行。3. 测定电导率：在测定前先将各管浸泡上下搅拌或摇匀再测定电导率，为了测定相对外渗 电导值，需将测国电导率的材料，再放入沸水中煮沸 10-20分钟，冷却至室温后再测一 次总电导率值。4. 电解质外渗量的表示：直接用电导率值表示电解质渗出率（）二浸泡液电导率值/煮沸后电导率值* 100温度校正：X25=Atl+0.02 （t- 25）X25为校正成25C时的电导率，At为在tC下实测电导率值
13、。参考植物生理学实验技术张宪政 P 333,辽宁科学技术出版社实验四、植物中氮磷钾元素的测定、 代测液制备：1、硫酸过氧化氢消煮法 试剂配制：（ 1 ） 浓硫酸：分析纯（ 2） 30%过氧化氢 测定步骤：称取 0.5000-1.000 克（通过 0.42mm 孔径）样品置 50ml 小开氏瓶中，用少量水湿润样 本后，加入浓硫酸5ml，摇动使硫酸与样本混合，放置半小时或过夜，在电炉上加热至瓶内硫酸开始回流（消化液呈酱红色，冒大量白烟），微沸5min，取下冷却，逐滴加入30%H2O2约0.5ml,再加热微沸5min，取下稍冷却，添加H2O2，反复操作，直至消化液完全清亮为止（最高温度不要超过350
14、 度）。添加H2O2量应每次逐渐减少。最后一次应微沸5min，以除尽100ml容量瓶中定容，摇匀备用。剩余的H2O2。冷却后先加入10ml蒸馏水，再无损地移如（注意：h2o2不能沾在开氏瓶上,以免影响磷的测定）.氮的测定用2N KCl提取：取新鲜土壤10g，放入100ml三角瓶，加入2N KCl50ml，用橡皮塞塞紧，振荡30 分钟，立即过滤于 50ml 三角瓶中（含量第可以 2.5：1）A 试剂：1）2）复合液 中。 催化液：28g NOH、5 gNa2EDTA2H 2O和50 g酒石酸钾钠溶于1L去离子水中，保存于棕色瓶150 g 水杨酸钠和 0.3 g 硝普钠溶于 1L 去离子水中，保存于棕色瓶中。3）显色液：200 g NOH和250 g苯酚定溶到1L，保存于棕色瓶中。4）混合液：催化液和显色液 1：1 混合，用前进行配制。5） 次氯酸溶液：60ml5.25%次氯酸钠溶液稀释到1L,保存于棕色瓶中。6）氮标准液：a：2. 5mgNH 4+-N/ml 储备液：11 79g （NH 4） 2SO4 定容至 U 1L。b： 10ugNH 4+-N/ml 工作溶液：吸收 1ml 储备液，稀释到 250mlB 步骤1 ） 打开分光光度计，预热 30 分钟。2）
