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1、 - 让每个人公正地提升自我DOJINDO 操作说明细胞活性检测1. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培育板放在培育箱预培育 (在 37 ，5% CO2的条件下 )。2. 向每孔参与 10 ml 的 CCK- 8 溶液 (留意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值的读数) 。3. 将培育板在培育箱内孵育 1-4 小时。4. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。5. 假设临时不测定 O.D 值，打算以后测定的话，可以向每孔中参与 10 ml 0.1 M HCl 溶液或者 1% w/vSDS 溶液，并遮盖培育板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发
2、生变化。细胞增殖 -毒性检测1. 在 96 孔板中配制 100 ml 的细胞悬液。将培育板在培育箱预培育 24 小时 ( 在 37，5% CO2的条件下 )。2. 向培育板参与 10 ml 不同浓度的待测物质。3. 将培育板在培育箱孵育一段适当的时间(例如: 6,12, 24 或 48 小时 )。4. 向每孔参与 10 ml CCK-8 溶液 (留意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值的读数) 。5. 将培育板在培育箱内孵育 1-4 小时。6. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。7. 假设临时不测定 O.D 值，打算以后测定的话，可以向每孔中参与 10 ml 0.1 M HCl
3、溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培育板避光保存在室温条件下。在24 小时内吸光度不会发生变化。留意：假设待测物质有氧化性或复原性的话，可在加CCK-8 之前更换颖培育基，去掉药物的影响。固然药物影响比较小的状况可以不更换培育基，直接扣除培育基中参与药物后的空 白吸取即可。制作标准曲线1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。2. 按比例 ( 例如：1/2 比例 ) 依次用培育基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。3. 接种后培育 2-4 小时使细胞贴壁，然后加CCK-8 试剂培育确定时间后测定 O.D 值，制作出
4、一条以细胞数量为横坐标 (X 轴) ，O.D 值为纵坐标 (Y 轴) 的标准曲线。依据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是试验的条件要全都，便于确定细胞的接种数量以及参与 CCK-8 后的培育时间)。DOJINDO 检测步骤CCK-8 检测步骤1. 向各孔中参与 100 l 细胞悬液。a)2. 在 37下预孵育培育板。b)3. 向各孔中参与各浓度的待测溶液 c)10 l。4. 37下孵育。5. 向各孔中参与 10 l 的 CCK-8 溶液 d)。6. 37下孵育 1-4 小时。e)7. 测定 450 nm 处的 OD 值。1a) 使用适当的培育基制备 50,000
5、-100,000 个/ml 的细胞悬液。b) 建议使用 CO2 培育箱过夜预培育。c) 使用培育基或 PBS 来制备溶液。d) 假设待测溶液有复原性，测定不含细胞，但含有 CCK-8 的待测溶液在 450 nm处的空白吸光度。假设该吸光度很小，则可以直接参与 CCK-8 ，假设吸光度相对较大，则需要除去培育基，并用培育基洗涤细胞两次，然后参与的 100 l 培育基和 10 l CCK-8 进展检测。e) 白细胞可能需要培育较长时间。活力计算细胞活力*=A(加药)-A空白/A0 加药-A空白 100 A加药：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度 A空白：具有培育基和 CCK-8 溶液
6、而没有细胞的孔的吸光度A0 加药：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力问答：1. 一个孔中应接种多少个细胞？当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 l 培育基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推举接种量不低于2,500 个/孔 (100 l 培育基)。假设要使用 24 孔板或 6 孔板试验，请先计算每孔相应的接种量，并依据每孔培育基总体积的10% 参与 CCK-8 溶液。2. 能否用 384 孔板进展试验？可以。向各孔中参与培育基体积10%的 CCK-8 溶液，假设参与的CCK-8 体积太少，
7、可以先将CCK-8 溶液稀释 1 倍，然后参与培育基体积 20%的量。3. 能否用 24 孔板进展试验？可以。向各孔中参与培育基体积 10%的 CCK-8 溶液。4.酚红会影响检测吗？不会。培育基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。5.CCK-8 与胸苷结合检测之间是否有相关性？有。然而，请留意由于 CCK-8 使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。6.CCK-8 能否检测细菌细胞？可以检测 E.coli，但不能检测酵母细胞。向 100 l E.coli 培育液中参与 10 l CCK-8 溶液，并培养 1-4 个小时或过夜。7.
8、CCK-8 稳定吗？CCK-8 在 0-5下能够保存至少 6 个月，在-20下避光可以保存 1 年。假设需要长期保存， 我们推举-20的贮存条件。8. 假设没有 450 nm 的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？还可使用 450 nm 到 490 nm 之间的滤光片。9. 如何削减由于 CCK-8 试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？ 可以在加样前用培育基稀释 CCK-8 试剂并混匀后加样。10. CCK-8 是什么颜色？应当是粉红色。假设颜色不一样，有可能会影响测定。11. CCK8 能否对活细胞进展染色？不能。由于 CCK8 的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST8)，并通过电子载体
9、 1Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培育基中的 WST8 上。由于生成的甲 也是高度水溶性的，因此CCK8 不能对细胞进展染色。12. CCK8 检测溶液对细胞是否有毒？CCK8 溶液自身由于高浓度的 1Methoxy PMS 的存在而具有一点毒性。但是，加到培育基中的CCK8 是没有毒性的，由于被稀释了10 倍。因此，长时间的培育，如过夜或者培育数天是可以的。同一个细胞培育液在CCK8 检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者 DNA 荧光检测等。由于每种细胞对于 CCK8 的耐受力都不同，因此在需要进展长时间培育时，先检测一下细胞在参与CCK8 培育后的活
10、力。13. 在做加药试验时，药物对测定是否有影响？如何解决？有时会有影响。假设药物具有复原性，会和CCK8 发生显色反响，增加吸光度。解决方法： 首先要确认药物是否有吸取，在含有药物的培育基中参与 CCK8，测定 450 nm 的吸光度，假设它的吸光度比不含药物的培育基 (加 CCK8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK8 之前更换培育基，去掉药物的影响。14. 每次测定的数值不一样，是什么缘由？如何解决？可能会有以下几个缘由： 1. 当在培育箱内培育时，培育板最外一圈的孔最简洁枯燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般状况下，最外一圈的孔只加培育基，不作为测定孔用。 2.有可能会由于
11、CCK8 沾在壁上而产生误差，建议在参与 CCK8 后，轻小扣击培育板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000100,000 个/孔范围内摸索条件。15. 如何设定空白比照？在不含细胞的培育基中参与 CCK8，培育确定的时间，测定 450 nm 的吸光度即为空白比照。在做加药试验(细胞毒性试验)时，还应考虑药物的吸取，可在不含细胞，参与药物的培育基 中参与 CCK8，培育确定的时间，测定 450 nm 的吸光度作为空白比照。16. 哪些物质会影响 CCK8 的测定？当有复原性物质存在时会影响 CCK8 的测定，例如含有维生素 C 的 Glucose 等 (一般培育基中的
12、量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的状况下，会增加空白吸取，但不影响测定，扣除空白吸取即可。17. 在试验中吸光度值太高，假设不能削减细胞数量，如何解决？可以缩短参与 CCK8 后的培育时间。例如：可以把参与 CCK8 试剂后的培育时间由 2 小时缩短为 1 小时。18. 设定参比波长的目的是什么？必需设定吗？不愿定要设定。CCK-8 试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸取。19. 说明书上仅写了 96 孔板的测定方法，假设使用 24 孔板货 12 孔板，应当加多少量 CCK-8试剂？一般状况下建议参与 CCK-8 试剂的量是培育基体积的 1/
13、10。20.在 CCK-8 显色过程中，如何终止反响？有一下几种方法96 孔板： 1、在显色反响后，将培育板放置4冰箱内。 2、每孔加 10 l 0.1 M HCL 溶液。 3、每孔加 10 l 1%w/v的 SDS十二烷基硫酸钠溶液。留意：反响停顿后，应在 24 小时之内测定。21. 必需预培育细胞吗？不愿定。假设要向保持细胞的最好状态，建议预培育细胞。假设不做细胞预培育，细胞内的 脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培育，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。22. 假设参与的药物中含有金属，是否会有影响？金属对 CCK-8 显色有影响。当终浓度为 1 Mm 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会
14、抑制 5%、15%、90%的显色反响，使灵敏度降级。假设终浓度是10 Mm 的话，将会 100%抑制。23. CCK-8 试剂的保存条件？在避光条件下 CCK-8 试剂在 4可保存一年。假设需要保存较长时间的话，推举在-20下保存。但是CCK-8 假设反复解冻和冰冻将会增加空白吸取，从而影响检测结果，假设常常使用可将试剂存放在 4冰箱内保存。24. 预培育后，更换培育基需要细胞计数吗？一般状况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成确定浓度的细胞悬液即可。假设想要周密计数细胞的话，可以预培育后取培育基用血球计数盘进展计数。25. CCK-8 对于不同的细胞，灵敏度是否一样？不
15、一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般参与CCK-8 培育 1-4 小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长 CCK-8 的参与时间或增加细胞数量来解决。26. 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区分？悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培育时间。贴壁细胞染色比较简洁，假设细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。27. 应当每次做标准曲线吗？建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不愿定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。假设试剂的批号不一样，灵敏度可能会有略微的差异，对于不同的批号 建议分别做标准曲线。28. 有时在药物作用状况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？不能。由于 CCK-8 是通过和细胞内的脱氢酶进展反响间接反映活细胞数量，假设细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量
