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1、宁波大学硕士研究生2009/2010学年第1学期期末考试卷考试科目： 实验生态学 课程编号： 07G13104A 阅卷教师： 陆开宏 姓名： 钱伟 学号： 0911091019 成绩： 90 微生物分子生态学研究方法进展摘要：现代分子生物学技术在生态学研究中的应用大大推动了微生物生态学的发展，导致了微生物分子生态学的产生。微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构与环境的关系。微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有核算探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝胶电泳方法等。这些技术方法的采用
2、，取得了一系列重要的成果和微生物生态学研究中的突破，使得对某些微生物的研究成为可能，并在分子水平上阐述了生态问题的机制。关键词：微生物分子生态学；核算探针杂交；PCR；变性梯度凝胶电泳Development in Research Methods of Microbial Molecular EcologyAbstract：Application of the modern molecular biology technology in ecology greatly promoted the development of microbial ecology, leading to the m
3、icrobial molecular ecology. Microbial molecular ecology compensated for deficiency of the traditional microbial ecology method making people avoid the traditional separation process and discuss the relationship between the population structure and environment directly. The application of molecular m
4、ethods such as nucleotide probes hybridization, PCR amplification technologies, r RNA sequence homology analysis method and denaturing gradient gel electrophoresis, etc. the adoption of these techniques had a series of important achievements, making the study of certain microorganisms become possibl
5、e and expound the mechanism of ecological problems under the molecular level.Keywords：microbial molecular ecology; nucleotide probes hybridization; PCR; denaturing gradient gel electrophoresis1 引言微生物生态学这门学科出现在20世纪60年代早期。之后，环境问题日益引起人们的关注。与此同时，微生物生态学得到了迅速的发展。20世纪末引入分子生物学技术之后，微生物生态学的研究得到了更深的发展。许多研究已经证实
6、，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%10%，远远不能满足微生物生态学研究的需要1,2。分子微生物生态学是分子生物学实验技术应用于微生物生态学研究领域而发展形成的一门交叉学科，在研究微生物生态系统的组成结构、功能的分子机理以及微生物与生物和非生物环境间的相互关系等方面显示了巨大的潜力。十几年来分子微生物生态学研究所取得的成就证明：分子生物学研究技术向微生物生态学领域的不断渗透，为微生物生态学研究领域注入了新的活力，尤其在微生物区系分子组成及变化规律、微生物多样性以及微生物系统进化研究方面取得了重大突破3。2 微生物分子生态学技术2.1 核算探针杂交技术核酸杂交技术能够灵敏
7、地探测出环境微生物中特殊的核苷酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。标记核苷酸探针可直接用来探测溶液中、固定在膜上、细胞或组织内的同源核酸序列。探针可以是长探针（100bp1000bp），也可以是短的寡核苷酸（1050bp）。杂交方式可以是狭缝杂交、菌落杂交或原位杂交35。荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, 简称FISH）是将DNA（或RNA）探针用特殊的荧光染料标记，然后将探针直接杂交稻生物样品的染色体或RNA上，以对某种基因或RNA进行定性和定位6。在微生
8、物生态学研究中，常以微生物的核糖体亚基为靶标设计寡核苷酸探针，最常用的靶标基因是核糖体小亚基基因（SSU rRNA），也有时用核糖体大亚基基因（LSU rRNA, 23/28SrRNA）。针对核糖体亚基基因建立的FISH技术最早是由Delong及其合作者报道的（Delong, 1989），此后二十年来发展十分迅速，技术日趋成熟（Amann,1995）7，已广泛应用于湖泊，土壤及极端环境等多种多样复杂的生态环境及样品中微生物区系结构和种群多样性的研究8。 传统的纯培养技术在定量测定污水处理系统中微生物数量上存在着极大的偏差，而核酸探针杂交技术既弥补了传统方法不能进行原位测定的不足，又克服了免疫探
9、针只能用于纯培养微生物以及絮凝物阻止抗体作用靶细胞的缺陷，而被广泛应用于污水处理系统中微生物生态学的研究。Wagner等首次利用核酸探针杂交技术对活性污泥中的微生物群落结构进行了分析，利用4种特异性核酸探针与活性污泥中的微生物进行全细胞杂交，通过落视荧光显微镜(epifluorescence microscope) 进行定量分析，结果发现活性污泥中处于支配地位的微生物分属于变形杆菌纲、和-亚纲，大约占活菌量的80 %。这是第一次在类群水平上对活性污泥中微生物群落结构进行原位分析。以16SrRNA、23SrRNA为探针的杂交技术在目前的许多研究中获得了成功，但是，对于某些特殊微生物群体，如低rR
10、NA含量但具代谢活性的微生物和高rRNA残留量但不具代谢活性的微生物，就不起作用。因此，有人提出使用前16SrRNA作为探针进行杂交。Cangelosi 等的研究证实了使用大肠杆菌前16SrRNA为探针检测自然环境中细菌生长状况比16SrRNA探针更灵敏且可行，建议使用这种可以量化rRNA水平的探针前16SrRNA探针来检测细胞的生长活性。因此，Daniel等将该技术引入污水处理系统中的原位检测。他们选择了具有高效除磷效果的不动杆菌（Acinetobacter）为研究对象，报道了其前16SrRNA序列结构及特性，并设计了相应的核酸探针，以此作为污水处理系统中评价该方法的模式体系。他们分别用16
11、SrRNA和前导16SrRNA为探针来监控纯培养条件下醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）的生长变化情况：发现前16SrRNA的水平在醋酸钙不动杆菌对数生长阶段的前期快速增长，末期开始下降；而16SrRNA的水平在对数生长阶段的中后期达到最高，下降趋势贯穿整个稳定期。这说明了前导16SrRNA 检测细菌生长变化的高灵敏性911。活性污泥法处理废水是今天环境保护中最重要的技术方法和工艺之一。但是，对其中的微生物共生体的群体结构和功能的相关性却知之甚少。活性污泥沉积物可以看作是固定化的生物膜，这个生物膜可共代谢很多有机化合物和环境污染物1214。网式探针杂交法(nested probe
12、 hybridyzation)正适合研究这个非常复杂的共生体：使用对不同分类单元特异性的探针进行从大至小过筛子似(Top-to-bottom)研究，第一轮杂交使用分别具有细菌域或古菌域特异性的探针，结果发现绝大多数细胞与细菌探针结合。第二轮用变形杆菌各亚纲（、）及其它谱系的探针进行杂交。结果发现每个探针都能探测几种形态类型。还应用相应的探针杂交用富营养琼脂富集样品得到的异养菌生长的平板。这表明，依赖培养的技术明显不适合分析活性污泥结构，因为原位杂交中大多数细胞只与亚纲探针杂交。第三轮杂交是用属的特异性探针杂交。结果发现，原位杂交的细胞只有1%10%的细胞与Acinetobacter的探针结合，
13、而在营养平板上，则有30%60%的菌落与之杂交。这使人们认识到以前认为没有选择性的培养基实际上是有选择性的，传统的依赖培养技术方法不适于描述微生物群落结构。这样的一套探针可用来分析各种生态体系。用上述探针对饮用水管道中生物膜研究表明，生物膜的微生物的系统起源多样。 Holger等15为弥补以上不足之处，综合运用 FISH 法、CLSM和数字图像分析等方法，设计了一套半自动测定污水处理系统中氨氧化菌浓度的方案：向样品中加入不同浓度的大肠杆菌，并用特定的核酸探针对加入的大肠杆菌（E）和未加入大肠杆菌(UE)的样品进行荧光原位杂交；利用数字图像分析法分析不同的样品，然后算出其峰面积比；从UE样品的峰
14、面积比中扣除E样品的峰面积比，然后将所得的各点绘制成双对数曲线图，并求出回归方程；根据公式将等价的大肠杆菌浓度换算成氨氧化菌的真实浓度。这一方案为污水处理系统中微生物数量的确定提供了一个既操作方便，简介，准确性高的途径10。2.2 基于PCR技术的研究方法PCR是1985年由Mullis发明的一种聚合酶链式反应技术，主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的的基因或DNA片段，使研究的目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得到无限的扩增，为微量微生物种群的研究提供了保证。PCR技术的发明和不断完善，为分子生物学的发展以及微生物分子生态学的发展和分析技术的建立提供了有力的工具。2.
15、2.1 PCR-RFLP方法末端限制性片段长度多样性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP）分析技术是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，其原理是根据某个标识基因（通常是核糖体小亚基基因）的保守区设计通用引物，其中一个引物的5末端用荧光物质标记，以待分析样品的DNA为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一端就带有这种荧光标记，然后用合适的限制性内切酶消化PCR产物。将酶切产物用DNA测序仪进行分析16。由于样品中不同微生物的扩增片段内存在核苷酸序列差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限
16、制性片段。但DNA测序仪只能检测到末端带有荧光标记的片段。因为不同长度的末端限制性片段代表不同的微生物，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。T-RFLP还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积就越大17,18。近十几年来该技术已经成功应用于各种环境中微生物群落多样性及结构特征等方面的研究。现在很多研究人员利用16SrRNA来研究土壤微生物的多样性。该技术还可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化。耕作过的土壤中的微生物种群结构的变化越来越多的引起人们的重视，Buckley DH等人提取土壤中微生物的RNA，通过标记过的不同引物扩增，确定16SrRNA的丰度58。2.2.2 PCR-SSCP方法单链构象多态性
