《USP附录翻译》由会员分享，可在线阅读，更多相关《USP附录翻译（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、高压液相色谱法高压液相色谱法（HPLC），有时也称为高效液相色谱法，是基于固体为固定相，液体为流动相的分离技术。分离是通过分配、吸附或者离子交换过程来完成，取决于所用的固定相类型。分析有机物方面HPLC比气相有明显优势。将被分析的混合物溶解在适宜溶剂中，且大多数分离在室温条件下即可进行。因此，大部分样品包括难挥发或者热不稳定性化合物可以被分离，而不需要分解或衍生成易挥发性物质。大部分药物分析是基于分配色谱，并且在30分钟内完成色谱分析。同在气相色谱中一样，化合物洗脱时间可以用容量因子k描述（参见符号术语表），它取决于被分析物的化学性质、流动相的组成和流速以及固定相的组成和表面积。柱长也是分离度
2、的重要的决定性因素。只有具有不同容量因子的混合物才可以被HPLC分开。仪器装置液相色谱是由流动相贮液瓶、在高压下能够使流动相通过系统的泵、将样品引入流动相的进样器、色谱柱、检测器和数据采集装置（例如计算机、积分仪或记录仪）组成的。短的、口径小的，含有密度较高的固定相填料的色谱柱可以为化合物在流动相和固定相间快速交换提供基础。除接收和报告检测器输出结果之外，计算机被用来控制色谱仪设置和操作，这样为长期无人操作提供必要条件。泵系统HPLC泵系统定量地将流动相通过高压管路和装置从储液瓶运送到色谱柱。现代的系统包括一个或更多计算机控制的计量泵，可根据编订好的程序按梯度色谱的要求来变化流动相的组成，或混
3、合无梯度的流动相（即流动相有固定的溶剂比值）。然而，在预混和的无梯度流动相中各种成分的比例，与那些用多个泵系统混合的相比，更能准确地控制。常见的情况为运行压力高达5000psi或更高，此时当泵的转送速度可达10ml/min。用于定量分析的泵应由惰性的耐流动相腐蚀的材料组成，且在输送流动相过程中以不变的速率运送流动相，同时可以很小的波动运行很长一段时间。进样器被测化合物在流动相或其他适当溶液溶解后，通过用注射器或定量环手动，或者用自动进样系统注入流动相。后者是由一个转盘或转送架和一个进样装置组成，转盘或转送架上面可以盛放带有可刺破的膜或塞子的样品瓶，进样装置可以将样品从样品瓶中转移定量环中从而进
4、入色谱系统。有些自动进样器可以设计程序来控制样品体积、进样次数和定量环清洗循环、进样时间间隔和其它操作变量。当柱头压力小于70个大气压（大约1000 psi）时可以用注射器通过隔膜手动进样。在高压力情况下，进样阀是必须的。一些阀系统将定量环合并在一起，将定量环内所装的供试品溶液在流动相中转移至色谱柱。在另一些系统中，供试品溶液被注射器注入空腔中，转动阀开关，进入流动相。色谱柱对于大多数药物的分析，分离是通过将供试品溶液在流动相和固定相之间分配来完成的。由非极性流动相和极性固定相组成的系统称为正相色谱，反之，由极性流动相和非极性固定相组成的系统称为反相色谱。分配色谱常被用于分子量小于1000的碳
5、氢化合物的分析。化合物对固定相的亲合力，以及因此而得到的在柱中的保留时间，可以通过调节流动相的极性高低来控制。流动相的极性可以通过加入第二种和第三种有时甚至是第四种成分而改变。现在典型的反相液相色谱的固定相是由有机相化学键合到硅胶或其他材料上而成。粒径通常为310m，但制备柱的大小可以达到50m甚至更高。带有薄层有机相包裹的小颗粒可以提供低质量传递阻力，因此可以提供化合物在固定相和流动之间的快速传递。色谱柱的极性取决于键合官能团的极性，它包括从相对无极性的十八烷基硅烷到强极性的硝基。液体，未键合的固定相基本上不得溶于流动相。即使如此，常常需要用固定相来预饱和流动相以防止固定相从色谱柱中被剥离。
6、包裹在支持物上的聚合物固定相具有更好的耐用性。用于分析分离的色谱柱内径通常为25mm；大内径的色谱柱用于制备色谱。对色谱柱升温可能会获得更有效的分离，但由于存在固定相降解或流动相挥发的可能性，故很少将其加热到60以上。除非在个论中另有规定，色谱均在室温下使用。离子交换色谱是用于分离分子量不超过1500的水溶性的、离子化的化合物的分析。固定相通常是合成的有机树脂，阳离子交换树脂含有负电荷活性位点，用于分离碱性物质，例如胺；而阴离子交换树脂含有正电荷活性位点，用于分离还有负电荷基团的化合物，例如磷酸、磺酸或羧酸。水溶性离子或离子化的化合物吸附到树脂上，亲合能力的不同产生了色谱分离。流动相的pH、温
7、度、离子类型、离子浓度和有机物修饰剂可以影响平衡，可以调节这些变量来获得所需的分离度。在分子排阻色谱中，色谱柱中填充的是多孔固定相。按照化合物分子量的大小进行色谱分离。分子量大的分子不能进入孔内而不保留地排出色谱柱。分子量小的分子进入孔内随分子量降低而保留时间增加。这些色谱柱典型地应用于测量聚合物和大分子的降解（见分子排阻色谱一节）。检测器许多药典的HPLC方法需要使用分光光度度检测器。这种检测器由在色谱柱的末端安装的一个流通池构成。紫外光穿过流通池进入检测器。当化合物从色谱柱上洗脱时，通过流通池产生吸收，导致测量的能量水平发生变化。固定波长、可变波长和多波长的检测器被广泛应用。固定波长检测器
8、只能在一个单波长下操作，典型的为254nm，由低压力汞灯发射光源。可变波长检测器含有一个连续的光源，例如氘灯或高压氙灯，用一个单色器或干涉滤光片在操作者所选择的波长处产生单色光。装有单色器的可变波长检测器的波长准确性需要按照生产厂商的程序方法进行检查，如果检测的波长偏离校正值超过3nm，就要对仪器进行重新校正。现在的可变波长检测器在分析过程中可以程序地变化波长。多波长检测器可以同时在两个或更多波长下测量吸收情况。在二极管阵列多波长检测器中，连续发射的光透过样品池，然后分解成其组成的波长，用二极管阵列分别检测。这些检测器可以获得在整个紫外-可见范围的吸收数据，因而可以提供给分析人员在多个、选择性
9、波长处的图谱以及各洗脱峰的图谱。二极管阵列检测器与固定波长检测器或可变波长检测器相比，有较低的信噪比，因此不适于分析低浓度的化合物。示差折光检测器测量只有流动相的折光率与含有从色谱柱中流出的被分析物的流动相的折光率之间的差异。示差折光检测器用于检测没有紫外吸收的化合物，但其灵敏度比紫外检测器低。它们对溶剂组成、流速和温度的微小变化非常敏感，因此需要一个参比柱来获得满意的基线。荧光检测器对那些本身具有荧光以及可以通过化合物的转化或与荧光试剂在特定的官能团下配对转变成荧光衍生物的化合物敏感。如果需要衍生化，可以色谱分离前衍生，试剂也可以在进入检测器前将其引入流动相中。电位、伏特或极谱电化学检测器用
10、于定量测定能在工作电极处被氧化或还原的样品。这些检测器有选择性、灵敏可信，但要求流动中不能溶解有氧气和还原性金属离子。必须使用无脉冲型泵，并且要确保流动相的pH、离子强度和温度保持恒定。工作电极容易被伴随产生的具有可变响应值的还原产物污染。还有碳糊电极的电化学检测器可以方便地用于定量测定纳克级的易氧化化合物，特别是酚类和儿茶酚类。新的检测器陆续被开发以克服正在使用的检测器的缺点。数据采集装置现在的数据工作站可以收集和贮存检测器输出的结果，并且可以输出峰高、峰面积、样品鉴定和方法变量的色谱图。它们(数据采集装置)也可以用于液相色谱编程，控制大多数变量，提供长时间的无人值守操作。数据也可以用简单的
11、手动测量记录仪或单独的积分仪来采集，它们可以完成从输出峰面积到输出带有峰面积和峰高结果计算的色谱图，以及贮存后来操作过程中得到的数据。操作步骤流动相组成可以很大地影响色谱性能和被分离的混合化合物的分离度。对于准确定量的测定，必须使用高纯度的试剂和“HPLC级”有机溶剂。使用的水要求具有低电导和低紫外吸收的适宜质量。特定类型检测器（例如电化学、质谱）所用的试剂，可能要求制定附加的条件，以避免潜在的干扰。对于容量因子k来说，组成比温度的影响更大。在分配色谱中，决定分离的分配系数可以通过在流动相中加入其它化合物而发生变化。在离子交换色谱中，流动相的pH值和离子强度以及组成都会影响容量因子。使用在色谱
12、运行的过程中连续变化流动相溶剂的组成的技术叫做梯度洗脱或程序溶剂。它有时用于容量因子差别很大的混合化合物的色谱分离。对于溶剂组成变化敏感的检测器，例如示差折光检测器，使用梯度洗脱技术比较困难。检测器必须具有一个很宽的线性动态范围，被检测化合物必须与其它干扰物分离。化合物的线性动态范围是指检测器信号响应值与化合物的量成正比的范围。对于定量检测的最大适应性，此范围应该有大约三个数量级。HPLC系统可以通过使用已知浓度的标准品与峰响应值作图，按外标法或内标法进行校正。如果使用自动进样器，可以用外标法获得可信的定量结果。这种方法可以通过直接比较供试品和标准品溶液峰响应值而直接获得。如果必须使用注射器进
13、样，由于在高压下的不重现性，需用已知量的不具干扰性的化合物做内部校正来获得比较好的定量结果，将内标物加入到供试品溶液和标准品溶液中，将药物峰面积响应值与内标物峰面积响应值的比值进行比较。由于仪器设备、进样和技术的正常变化，需要进行系统适用性试验以确保给定的操作系统是可用的。系统适用性试验的主要特征在下文中阐述。对结果解释，见色谱图解释一节。5USP 30 分光光度法鉴别测试分光光度检测用于许多药典上化学物质的鉴别。后述的检测方法适用于有红外和/或有紫外吸收的物质（见分光光度法和光散射法）。 物质的红外吸收光谱，与相应的USP标准品所得图谱进行比较，可提供从任何单个测试中获得对该物质最具确证力的
14、鉴别。另一方面，紫外吸收图谱不能显示高度的专属性。红外吸收与紫外吸收图谱两者都与测试指标一致，便可对物质的鉴别作出结论，如果还有疑问，则需要参考其他鉴别项目。红外吸收对预先干燥的被测样品与标准品的制备的六种方法作简要说明。个论中197K指被测样品与溴化钾混匀。个论中197M指被测样品研细后，分散于矿物油中。个论中197F指被测样品均匀悬浮在合适的（如氯化物，溴化钾）片中。把样品用石蜡或个论中规定的溶剂溶解后涂在两片溴化钾或氯化钾之间再扫描。个论中197S指用个论中指定的溶剂配制指定浓度的溶液，该溶液置于0.1-mm吸收池中检测，除非个论中规定不同的路径长度的吸收池。个论中197A指被测样品混有
15、用于衰减全反射比（ATR）的内反射元素。个论中197E指被测样品在用于IR显微镜分析的合适的片上被压成薄样品。当进行定性测试，标准品图谱用与供试品相同的方法获得时，197A和197E可以作为197K, 197M, 197F和197S的替代方法。除非个论中另有规定，记录供试品与相应的USP标准品在2.6 m 15 m (3800 cm 1 650 cm 1)范围内的图谱。除非另有规定，或除非标准品使用前不需要干燥，对供试品预先进行干燥，干燥条件与相应的标准品的干燥条件相同，再制备供试品的红外吸收光谱，该光谱与同法制得的USP标准品红外吸收光谱在相同波长处显示最大吸收。如果有多晶型存在，依法制得的
16、供试品光谱与标准品光谱可能有差异，这通常不可接受（见分光光度法和光散射法操作程序所述）。除非个论中另有规定，按如下所述继续操作。当供试品图谱与标准品图谱显示差异时，用合适的相同体积的溶剂分别溶解相同数量的供试品与标准品，使用相同的容器，在相同的条件下蒸发溶剂至干，用残渣重复检测。紫外吸收个论中197U，除非个论中另有规定，指供试品溶液与标准溶液用分光光度法测定，使用1-cm吸收池，光谱范围为200400nm.用指定的溶剂（Medium）溶解一部分被测样品配制供试品溶液，该溶液的浓度见个论中Solution下的规定。同法配制USP标准品溶液。记录并比较供试品溶液图谱与标准品溶液图谱。个论中有要求时，计算吸收率和/或吸光率。除非另有规定，这些计算中的吸光率指在个论中规定的波长处测得的最大吸收。如果在指定波长处测得的吸光率
