抗生素的发酵生产

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1、抗生素的发酵生产抗生素的发酵法生产摘 要:对马杜霉素，螺旋霉素，农用抗真菌素的发酵生产，确定其最佳的发酵 条件，并且对其各自发酵工艺进行比较，深入的了解用发酵法产抗生素 的原理及方法。关键词:马杜霉素 螺旋霉素 农用抗真菌素 发酵生产引言采用发酵工程技术生产医药产品是制药工程的重要部分，其中抗牛素是我国医 药生产的大宗产品，随着基因工程技术的进展，基因工程药的比例逐渐增大。但抗 生素在国计民生中所起的作用是能完全替代的。特别是西方同家出于能源和环保的 考虑，转产生产高附加值的药物，留出厂抗生素的市场空间，为我国的抗生素生产 发展提供了机遇，作为一个发展中的国家，可以说在相当长时间内，我国抗生素

2、生 产在整个医药产品巾仍占很大的比例，因此抗生素类发酵过程优化技术研究对医药 行业的生产具有重要的经济和社会意义。抗生素发酵过程优化研究中主要存在的问题长期以来为提高抗生素发酵水平，把注意力主要放在菌种筛选与改造，或从国 外引进菌株。近年来，随着现代牛物技术的日益发展，尤其是基因工程和代谢 1: 程技术的发展，已经取得了引入注目的效果，主要有:(1)将生物合成途径中关键酶 基因克隆来改良现有抗生素生产菌种;(2)将抗生素生物合成产生副产物的酶基因敲 除，以提高产生抗生素的能力;(3)克隆外源基因以改良原菌种的发酵生理特性;(4) 克隆外源抗生素合成基因簇来合成新的抗牛素等，但是在通过各种方法得

3、到一个高 产菌株后，在实际发酵操作时，往往忽视厂生物反应器中上程问题所必须加以考虑 的工艺变化和过程优化。随后的逐级放大与优化基本上是以最佳工艺控制点为依 据，采用人工经验为主的静态操作，在方法上基本以正交试验为基础。因此，发酵 过程优化与放大始终是生化上程中一个复杂问题的两个侧面，人们从不同的角度进 行研究。此外，随着计赞机技术的迅速发展，各抗生素发酵工厂已普遍采用计算机 在线控制，主要在补料操作上采用杯式流加技术，基本上满足了抗生素工业发酵生产上所需要的高精度控制补料速率问题，对提 高发酵效价起了重要作用。但由于对抗生素发酵过程的认识不能深入，对操作条件 变化的适应能力差，为此，许多抗生素

4、发酵工厂在生产罐上义进一步配置了溶氧电 极、DH电板，甚至排气氧和二氧化碳浓度测量。但对测量参数及其变化的意义缺 乏理解(由于以动力学研究为根据的反应器设计原理的局限性，不能深入解释。例 如发酵过程溶氧变化意味着什么?是基因水平，细胞水平，还是反应器工程水平问 题。大多仅停留在经验法则，缺乏过程分析的理论指导，因此，计算机控制只能解 决批间操作的不稳定问题，对发酵获得的高效价批号不能总结，一个新品种的投产 仍需很长时期，实际效果不明显。因此，在综合各种检测参数的基础上，提出发酵 过程的优化控制理论，切实可行地解决工业生产中实际问题就成为当前业发酵迫切 需要解决的重要课题。以下主要介绍了几种抗生

5、素的发酵生产的过程。1.马杜霉素发酵生产的过程马杜霉素是一种聚醚类离子载体型抗生素，由马杜霉拉放线菌(Ac tinomadura yumaensis)产生。一般都以铵盐的形式存在，也称马杜霉素铵，其分子式为 CHON，结构式如图所示，主要用作抗球虫药物。478317HQCH,HO CH?COONH4图I马社纂累技的结构式马杜霉素是聚醚类抗生素中效力最强的离子载体型抗球虫剂，可有效地控制多 种致病性艾美耳球虫。马杜霉素的特殊分子结构使其能特异性地与钠、钾、钙、镁 等阳离子结合成脂溶性的络合物，协助这些阳离子通过细胞膜大量进入球虫体内， 从而破坏了细胞内外离子的正常平衡和移动能力，对跨膜运输的糖、

6、氨基酸、有机 酸等的通透性以及离子特异性蛋白质与核酸的机能均产生影响，导致球虫体内新陈 代谢紊乱，不能正常增殖。与此同时，大量离子的进入使细胞内外形成了明显的渗 透压差，为了平衡渗透压，大量水分进入球虫细胞内，最终导致虫体膨胀破裂而 死。1.1 材料与方法1.1.1 菌种马杜霉拉放线菌，为本实验室保存的改良菌株。1.1.2 培养基伊莫松琼脂培养基(g/L):葡萄糖10，蛋白胨4,酵母膏1,牛肉浸膏4, NaCl2.5，琼脂 20，培养基初始 pH 值7.0。液体种子培养基(g/L):葡萄糖30，豆饼粉8,玉米浆8, NaCl 3, CaCO 1, 3 初始pH值7.0。分批发酵培养基(g/L)

7、:葡萄糖80,豆饼粉14，玉米浆14, NaCl 3，CaC01，3 KHP0 0.3, Fe(S0) 0.1,初始值 pH 6.6; 23243补料分批发酵初始培养基(g/L):葡萄糖40，豆饼粉7,玉米浆7, NaCl 3,CaC0 l, KHP0 0.3, Fe(S0) 0.1,初始 pH 为 6.6。323243补料培养基(g/L):葡萄糖200,豆饼粉35,玉米浆35, pH 6.6。1.2马杜霉 素发酵工艺1.2.1种子培养从-20?下保藏的甘油管菌种接种到平板伊莫松琼脂培养基上,32?培养-13-4d，活化后移入液体种子培养基中，32?、200 r?min条件下振荡培养2- 3d

8、,制成液体种子。1.2.2分批发酵工艺采用瑞士 BIOENGINEE耻NG公司生产的KLF2000型自控式发酵罐，总容积3(7L,装液量2.5 L,接种量4,，在34?, 一定通气速率和一定搅拌速率下培养192h,每隔12h取样分析测定。1.2.3间歇补料分批发酵工艺发酵罐初始装液量2.0L，预留500mL补料体积。发酵36h后，每隔12h补料一 次，每次加入50 mL补料培养基，分10次加完。最终补入成分的总浓度为：-1-1-1葡萄糖40g?L，豆饼粉7g?L，玉米浆7g?L。在与分批发酵相同的培养 条件下发酵192h，每隔12h取样分析测定。1.2.4马杜霉素分离提取马杜霉素是胞内产物,发

9、酵液内含量很少,一般均在5,以下。将含有菌体,1的发酵液在4000 r?min下离心15min,弃去上清液，收集菌丝体，用乙酸 乙,1脂提取过夜，将提取物在3000 r?min下离心5min，上清液即为马杜霉素提 取液。1.2.5马杜霉素测定将lOL此马杜霉素提取液与lmL酸性香草醛试剂及4mL甲醇试剂充分混匀后，置于70?水浴中保持25min，冷却后于515nm波长处测定其吸光值，并与采用 马杜霉素标准品制作的标准曲线相对照，即可得马杜霉素的发酵单位（用口-1g?mL 表示）。1.2.6菌体生物量测定-1发酵液在4000 r?min下离心10min后，弃去上清液，收集菌体细胞，于 105?下

10、烘干至衡重，置干燥器中冷却后用电子天平精确称量，扣除容器质量，即得 菌体干重。1.3马杜霉素发酵工艺的控制 1.3.1分批发酵中通气量对马杜霉素生产的影响马杜霉拉放线菌是一种好氧菌，在其培养过程中通气量是一个非常重要的控制 参数。一般情况下增大通气量可增加溶氧度，获得更多的生物量，但通气量太大会 造成泡沫过多，引起泛罐。本试验在3.7L发酵罐（装液量2.5L）中进行，在-13-134?、搅拌速率400 r?min的条件下，分别采用0.09、0.12、0.15和0（18 m?h四种不同的通气量进行分批发酵。结果表明：随着通气量增大，溶氧度升 高，马3-13-1杜霉素的发酵单位也相应增加:但当通气

11、量从0.15 m?h升高到0.18m?h时，溶氧度的升高己小明显，马杜霉素的发酵单位也增加不多，且到发酵后期有所下降。由于通气量较大时，泡沫迅速增多，会产生泛罐或从出气口逃液的 现3-1象，易引起染菌，所以综合考虑，本实验条件下采用0.15 m?h的通气量较 为-1适宜，马杜霉素发酵单位最高达7361 口 g?mL。1.3.2分批发酵中搅拌速度对马杜霉素生产的影响 增大通气量虽然可以改善发酵罐中的溶氧状况，但到发酵中后期溶氧度还是急 剧降低，说明仅靠增大通气量改善溶氧状况的效果还不够理想，因而进一步考察搅 拌速度对马杜霉素发酵的影响。在3.7L发酵罐（装液量2.5L）中，34?、0（15 3-

12、1- 1m?h通气量条件下，分别选择300、400、500和600 r?min四种不同的搅拌速度 进行分批发酵。试验结果表明:当转速较低时，菌体生物量和马杜霉素产量虽然在 发酵早期均增长较快，但随着菌体的增殖，溶氧度迅速下降，导致发酵中后期葡萄 糖的利用率下降，马杜霉素产量无法进一步提高，因而最终发酵单位也不高:当转 速较高时，则出现早期菌体生长不旺盛的情况，说明过高的搅拌速度产生的剪切力 对早期菌体的生长不利，导致马杜霉素的生长曲线延后，发酵平衡期缩短，不利于 马杜霉素的形成，虽然发酵后期葡萄糖的利用率有所提高，但马杜霉素的最终发酵 单位还是受到一定的影响。在本实验条件下，适宜的搅拌速度-1

13、-1为500r?min，马杜霉素发酵单位最高达7984 口 g?mL。1.3.3间歇补料分批发酵生产马杜霉素 由于马杜霉素是胞内产物，菌体的大量形成是马杜霉素高产的基础;同时，由 于马杜霉素是次级代谢产物，当菌体生物量达到一定浓度后，采用补料分批发酵技 术，使葡萄糖维持一定的浓度水平，有利于延长发酵平衡期，从而提高马杜-1霉素的产量。在间歇补料分批发酵试验中，初始葡萄糖浓度为40g?L，发酵 36hT后，葡萄糖浓度降到27g?L左右时开始补料。每次补料后培养基中葡萄糖浓 度-1-1 上升4-5g?L，在补料期间，葡萄糖浓度基本维持在15-30g?L之间。补料 lO次后，菌体密度已很高，发酵液很

14、黏稠，继续补料对马杜霉素生产无益，故停 止-1-1-1补料。总计补入了 40g?L的葡萄糖，7g?L的豆饼粉，7g?L的玉米浆，培3-1养液中的碳、氮源总浓度与分批发酵相同。发酵过程在34?、0(15m?h和500-1r?min条件下进行，结果所示:在24-156h期间，菌体生长较快，且以大至恒-1定的比生长速率生长，最终的菌体干重达51.8 mg(mL，比分批发酵增加了16.7,。同时，因为葡萄糖浓度较长时间维持在适宜的水平，马杜霉素的合成期-1延长，最终发酵单位达974 口 g?mL，比分批发酵提高了 22.1,。1.4结论(1)马杜霉拉放线菌是好氧菌，发酵体系中的溶氧度是影响马杜霉素发酵

15、水平 的重要因素，提高通气量和搅拌速度都可以增加溶氧，有利于产物合成。在3.73-1L发酵罐(装液量2.5L)中，适宜的通气量和搅拌速度分别为0.15m?h和500 -1-1r?min，在此条件下分批发酵生成的马杜霉素发酵单位达7984口 g?mL。 (2) 由于较高搅拌速度产生的剪切力对发酵前期菌丝体的生长不利，所以采用分段控制搅拌速度的工艺更有利于马杜霉素的生成。控制搅拌转速在晰O h为 -1-1-1r?min，60-120 h 为 500 r?min，120-192h 为 600r?min，马杜霉素 300 -1-1发酵单位可达8612 口 g?mL，比固定500r?min转速时提高7.

16、9,。 2.螺旋霉素高产菌种选育及发酵工艺优化2.1螺旋霉素概述大环内酯类抗生素的结构特点是分子内含有大的内酯环。它们的结构相似，均 由两部分组成:其中之一为非糖部分即具有1216元骨架的大环内酯部分:另一部 分为糖基部分，一般含有1-3个糖或氨基糖。碳霉素A是被人们发现的第一个16 元内酯环抗菌素，随后又陆续发现了柱晶白霉素和螺旋霉素，它们均由链霉菌产 生。它们的结构式分别于1975年和1965年被确定。螺旋霉素共有三种组份，其结 构式见图1.1。其中心结构为16元内酯环，内酯环上连接两个N甲基碳霉糖和 一个碳霉糖分子。slructurt of ipintmytliiig2.2螺旋霉素菌种选育的研究进展2.2.1菌种特性螺旋霉素的合成基因部分