《基因操作技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因操作技术（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1. 载体的定义？ 载体：指携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。2. 载体必须具备的3个基本条件?载体的碱基对越多越好？（1） 基本条件：1具有复制子，能在宿主细胞内自主复制，并携带重组DNA分子一同扩增； 2具有单一限制性内切酶的酶切位点或多克隆位点；3有合适的选择标记基因，用来筛选重 组DNA。（2） 载体的碱基对越少越好，能够更好的控制目的基因3. 目前研究最深，使用最多的载体有？ 目前研究最深、使用最多的载体是经过改造的质粒载体和噬菌体载体。4. 按功能分，有哪些载体？克隆载体的概念？表达载体的概念？ （1）按功能分，可分为克隆载体、表达载体、测序载体、转化载体
2、、穿梭载体、多功能载体等。（2）克隆载体：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质的产物。（3）表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、PBS、终止子），使目的基因能够表达的载体。5. 选择标记有哪些？插入失活、a-互补是什么意思？ （1）选择标记有插入失活和a-互补（2）插入失活:若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使基因失活，丧失其原有的表性特征。（3）a-互补：单独存在的a及w片段均无半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。6. 列举常用的质粒载体名称？ PBR32
3、2质粒、PUC载体、TA克隆载体7. 噬菌体的溶原状态是指？ 噬菌体感染大肠杆菌时，可能进入一个溶菌循环，结果导致细胞的裂解，释放出噬菌体颗 粒；或者进入与宿主不同程度的稳定状态。8. 噬菌体DNA由哪三个部分组成？目的基因插入哪个部分？ （1）噬菌体DNA由左臂、中臂、右臂三部分组成。（2）目的基因插入中臂（非必须区）部分。9. 超级载体的特点？有哪些超级载体？ 1）超级载体的特点：运载量大（2)超级载体：YACs、BACs10. 表达载体与克隆载体有什么最大的区别？ 表达载体有强大的启动子和SD序列，而克隆载体没有11. 限制性内切酶 限制性内切酶：能识别DNA分子上的特定位点并将双链DN
4、A切断的酶12. DNA连接酶，T4连接酶 DNA连接酶：一种能够在两条DNA链之间催化5-P和3-OH形成磷酸二酯键的酶 T 4连接酶：连接黏性末端或平末端的酶13. DNA聚合酶，Taq聚合酶 DNA聚合酶：催化脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）聚合成DNA的酶 Taq聚合酶：从嗜热水生菌中分离纯化出来的 14. 逆转录酶 逆转录酶：又称依赖于RNA的DNA聚合酶，是分子生物学中最重要的核酸酶之一。15. 核酸酶，DNase,Rnase 核酸酶：通过切割相邻两个核糖酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子发生水解断裂的蛋白酶 DNase:即脱氧核糖核酸酶，特异水解断裂DNA分子的酶 RNas
5、e:即核糖核酸酶，专门水解断裂RNA分子的酶16. 碱性磷酸酶，细菌性/小牛肠碱性磷酸酶 碱性磷酸酶：有两种不同来源的碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶；一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶。它们能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端。 细菌碱性磷酸酶：一种是从大肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶 小牛肠碱性磷酸酶：一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶17. DNA与基因的区别？ 基因是有遗传功能的DNA片段18. DNA的链是通过什么方式连接的？两条DNA单链是通过什么键连接在一起的？ （1）
6、磷酸二酯键；（2）氢键19. DNA中四种碱基对的名称？ A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、T(胸腺嘧啶）20. DNA和RNA的区别？ （1）DNA是脱氧核酸；RNA是核糖核酸；（2）这两种核糖的区别在于脱氧核糖2-碳原子上的羟基被脱了氧，只剩下H，这个区别使得DNA比RNA更具有化学稳定性21. 遗传信息是如何表达（翻译、传递）的？ P1822. mRNA,tRNA,rRNA的功能分别是什么？ mRNA功能：信使 tRNA功能：转运 rRNA功能：仓库23. 基因突变有哪几种类型？ 染色体突变，特点突变24. 操纵子的概念？ 概念：在细菌中，一组基因受一个启动子控制，被转录成一个长
7、的RNA分子，这样的一组基因成为操纵子。25. 简述乳糖操纵子的作用机理？26. 增强子的概念？沉默子的概念？ 增强子的概念：能强化转录起始的一段DNA序列为增强子或强化子 沉默子的概念：也称为沉默子元件，能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。27. 真核生物，原核生物，病毒的基因组特点？ 真核生物基因组的特点：1基因组通常比较大2）含有内含子序列3）有大量重复序列4）表达调控较复杂 原核生物基因组的特定：1)染色体不与组蛋白结合2)不同生活习性下原核生物基因组大小与GC含量有关 病毒基因组的特点：1）种类单一2）单倍数基因组，每个基因在病毒中只出现
8、一次3）形式多样4）大小不一5）基因重叠6）动物、细菌病毒与真核、原核基因相似，内含子7）具有不规则的结构基因8）基因编码区无间隔，通过宿主及病毒本身酶切9）无帽状结构10）结构基因没有翻译起始序列28. 基因操作基本步骤？ 基本步骤：扩、切、接、转、增、检29. 目的 基因分离有哪些方法？分别有什么样的特点？ 分离方法：1）鸟枪法2）反转录法3）人工合成法特点1）鸟枪法：操作简单，广泛使用，工作量大，盲目有时并非一个基因 2）反转录法：专一性强，操作过程麻烦，mRNA很不稳定要求的技术条件高 3）人工合成法：专一性强，仅限于合成核苷酸对较少的简单基因30. PCR技术的目的是什么？操作的步骤
9、和各步骤中发生的反应分别是什么？ PCR技术的目的是：能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 操作步骤：循环变性退火延伸 反应：循环变形：通过加热使模版DNA完全变性成为单链同时引物自身和引物之间存在 的局部双链也得以消除 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模版DNA退火结合 延伸：将温度升高，热稳定后DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新的DNA链31. 基因操作的理想载体是什么？ 理想载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒32. DNA/RNA提取过程中有哪些注意事项? DNA提取注意事项：1)DNA样品不纯2)DNA降解3)DNA提取量RNA 提取注意事项：1）RNA样品不纯2）RNA得率低3）RNA
10、容易降解33. 什么原因导致其不纯？对策？34. 什么原因导致得率低？对策？ P80 8435. 什么原因导致降解？对策？36. 简述常见的核酸检测方法？ 1）紫外光谱分析法2）荧光分光光度法3）凝胶电泳法37. 纯DNA的00260/280？纯RNA的00260/280？ 纯DNA的OD260/OD280应大于1.8 纯RNA的OD260/OD280应达到2.038. 荧光分光光度法的特点？ 灵敏度高2）信息多3）专一性强39. 凝胶电泳法的大致机理？ 机理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动40. 影响核酸保存的关键因素？ 1、保存液的酸碱度 2、保存湿度41. 提纯的核酸如
11、何保存？ 固态核酸通常在0以上低温干燥保存即可。小分子核酸保存温度还可以更低一些。 液态核酸室温容易变性，短期最好低温（4摄氏度）保存。42. 遗传物质提取过程中有哪些常见的缓冲溶液？ EDTA Tris-Hcl TAE TBE TE43. 核酸提取的两个原则？ 1.应保证核酸一级结构的完整性 2.排除其他分子的污染44. 核酸提取应注意哪些问题？ P80 8445. 核酸提取的基本步骤？ 破碎、提取、纯化46. 常见细胞的裂解方式？ 1、物理法 超声波、研磨法或匀浆法 2、化学法 EDTA或SDS 3、酶解法47. 常见样本的提取方法？ 1.浓盐法 2.有机溶剂抽取法 3.密度梯度离心法48
12、. 吸附材料结合有哪些常用的介质？ 硅质材料，阴离子交换树脂，磁珠49. 去除DNA中的RNA用什么酶？去除RNA中的DNA用什么酶？去除蛋白质用什么酶？RNase DNase 蛋白酶K50. 核酸提取过程中有一步叫酚-氯仿处理的过程，酚、氯仿、异戊醇的作用分别是什么？酚：蛋白质变性剂氯仿：分离更彻底异戊醇：消泡剂51. 为什么碱变性是可以从细菌中提取质粒？ 细胞基因DNA是线性的，把ph升至12，氢键会断裂，基因组会变成线性从而可以分开，质粒相对基因组DNA要牢固，不容易破裂，仍然保持超螺旋，尽管高ph打断氢键，两个环形链也不能分开。52. 电泳的定义/概念/ 带电颗粒在电场的作用下，向着与
13、其电荷相反的电极移动，称为电泳53. 电泳的基本原理（分离样品为什么在电泳里迁移速度不一样）？ 带电性质、分子大小、形状等不同54. 影响电泳分离的主要因素（外因）有哪些？ 1、电压2、ph缓冲液3、离子强度适量0.02-0.2 4、电渗 5、介质筛孔大小 6、缓冲液的黏度55. 琼脂糖电泳中的琼脂糖是什么？低熔点琼脂糖有什么用途？琼脂糖电泳的孔径是由什么决定的？琼脂糖电泳尤其适用于什么？如何检测（用什么染色，染色原理）琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取出来的线性多，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质。低熔点琼脂糖主要应用于染色体DNA琼脂糖内包埋后原位进行内切酶酶切、DNA片段回收以及小DNA片段
14、的分离。琼脂糖浓度适用于分离、鉴定和纯化DNA片段。用EB染色，在紫外灯下，凝胶中1ngDNA即能直接观察到。(EB染色键多，易吸收紫外光显色。）56. 简述琼脂糖电泳的操作步骤？ P12557. 分子量相当的情况下，线性DNA、共价闭环DNA、开环的双链DNA迁移速度顺序是？ 共价闭合DNA线性DNA开环的双链DNA58. 聚丙烯酰胺凝胶电泳介质孔径由什么决定？ 通过改变丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺的浓度比例决定59. 聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳相比哪个分辨率更高？为什么? 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分子筛效应，又具备静电效应。60. 聚丙烯酰胺凝胶电泳为什么要用双层玻璃板灌胶？ 封闭的双层玻璃平板的夹层中灌胶，仅有顶层的部分凝胶与空气中的氧气接触，从而大大的降低了氧对聚合的抑制作用。61. PCR技术的中文名？目的？原理？请简述 答:PCR即聚合酶链式反应。目的:通过重复循环变性、退火、延伸三个基本反应将所需目的基因在体外成千上百万倍的扩增。原理:模板DNA通过加热至95使DNA双链解离，使之形成单链，退火至温度为55-60引物与单链结合，最后升温至72DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下进行延伸,
