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1、HB全基因组克隆转染细胞系的建立 作者:赵艳芳,闫永平,苏海霞，王安辉，张磊，张景霞，门可,徐德忠 【核心词】 肝炎病毒,乙型;基因组,病毒；克隆,分子;转染；细胞培养；基因体现 【sat】AIM:To constct anew ell cultue system fr proucin HB n: Fllength HB DNA was cloed topNA3vector (name pcDNA3HBV).Hep2 cells retranfcted th pcNA33HBV andsceenedit antiotic G418 HBsA nd HB wee detfiedbyEIA a A
2、g as identified b immucytochicastaini. S gen RNA exressio was estd by RTPCR ndHBV DN he sprnant o trsfected cell was estby PR.RESLTS：Te asmid pNA3HBV was cnstucted succesfully ftaberasfcti, HBsAg andHBeAg cul e eect in thsuprnatant tansfed ells. HBcg oivesaning ws loctedinly inte cytoplasm. S gene R
3、NA expression wa verifie S gn and preS ne could b detece inesupernatant by RTPCR. Th copes ofHBV ome canea 108coi deeced byrealtime utiatv PCR. CONCLUSION: einantlasdpcNA33HBV coul be exprsed,tanscibednd plcated nH cels. Thistfctionbasedcel cutue systmculd prodce ih cpie o Bgnom. 【eyors】pttis B rus;
4、 gnome, viral； cloning， moeculor； transfection; cll culture;gen expresion【摘要】 目的： 建立BV体外细胞培养体系. 措施: 构建BV全基因克隆质粒pcDA33HBV,稳定转染Hp2细胞，G418筛选 ELISA检测细胞上清液HBsAg,BeAg的体现,免疫组化检测细胞内HBcAg的体现,RPCR检测细胞S基因RA的体现，PCR检测细胞上清液D 成果: 成功构建了B全基因克隆质粒cDNA3HB，稳定转染Hep2后,培养上清HBsAg，HBeA阳性，细胞内HBcA呈核浆型分布,且以浆型分布为主. TPR证明有HV 基因 m
5、RNA 的体现，上清中HBV S及前基因阳性,荧光定量CR检测显示培养上清中HBV 滴度达118拷贝/. 结论: 重组质粒pcDNA33HBV能在Hep2细胞中体现、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV. 【核心词】 肝炎病毒，乙型；基因组,病毒；克隆,分子;转染；细胞培养；基因体现 引言 由于V宿主范畴窄、动物模型缺少，体外组织培养也始终没有太大进展，且不能在体外人工培养,制约了对HV的研究. 将HB DNA转移至靶细胞，建立体现的体外培养细胞模型对研究HV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义2. HBV基因组呈双链闭合环状,基因构造紧凑，其开放读框分布于全长DN,为使完整的转染基
6、因能在细胞内复制,目的基因的长度要不小于一种HBV DA单元56. 我们构建3倍HBV基因的重组真核体现质粒，转染细胞，以筛选获得稳定体现病毒蛋白的细胞模型,并研究其产生HV的水平 1材料和措施 材料HBV全基因亚克隆载体pU1HBV为U19在co及Hin位点中插入头尾相连的HB（ad亚型)三连体,由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠,保存在大肠杆菌DH5中. 真核细胞体现载体pcDNA由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠;人肝母细胞瘤细胞系(Hp2)由第四军医大学微生物学教研室惠赠,本室传代培养；内切酶ER,Hn, T4 DN连接酶,T DN聚合酶,反转录酶及DNArer
7、(TakaRa公司);质粒提取试剂盒(西安市莱博科技发展有限公司)；LpofectamineTM 2XX（nitrogen公司）;DMM培养基,G1（Gibco公司)；新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)；ELSA检测试剂盒（上海科华 生物工程股份有限公司);ABC免疫组化试剂盒,AB染色剂（武汉博士德生物工程有限公司)；S基因，cti 及HB前S基因引物均由北京赛百胜公司合成. 措施 和pcDN3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养 pUC13HBV和pcDNA,以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HV和pcN，分别以EcoR,Hn单酶切pUC19HBV,以EcR,Hi双酶切pC19
8、3HV和pDNA3，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,运用胶回收试剂盒回收960 bp HBV全长基因片段和线性pcDA. 重组质粒的构建及鉴定HV A与线性pcDN以浓度比1混合，在T4 A连接酶作用下4连接1 连接产物转化感受态细胞5. 随机调取抗性菌落，经小量扩增,提取质粒，分别以EcoR,Hnd单酶切并以两者双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定. 脂质体介导下pcDN3HB基因转染转染前一日将处在对数生长期的HepG2细胞用胰酶消化并换无抗生素的DE培养基,将细胞接种于2孔板,密度达90%时进行转染.转染措施按阐明书进行. 24 后传代,48h换含60 m/
9、LG18培养基进行筛选. 设未转染的eG2细胞为对照. 待对照组细胞所有死亡后，用含300 g/G418的培养基维持.筛选过程不含其她抗生素 测抗原体现取转染细胞的上清液用ELIS法测HBAg,HBeA操作及成果鉴定按EIA试剂盒阐明书进行,终结反映后i内用酶标仪检测450 nm值 染色法检测细胞中HBcAg的体现rito X100解决,封闭非特异性抗原反映,依次加入一抗（兔抗人Hc Ab）、生物素化的二抗(羊抗兔IG)和SABC复合物,D显色，脱水透明,封片观测 检测细胞中S基因mRA的体现提取细胞总RNA,反转录为cD, 以act （sse: 5CCCATCATGTTGAGA 3; ant
10、nse: AGCTCTTCCGGGGA)为内参照,扩增片段长度为61 bp.以S基因引物（en: 5CTGCTGTGGCTCCA 3；antine: 5CTACCACATCATCT 3）做PC反映,扩增产物为500 bp. 反映条件为4预变性5in 后开始循环,9450s,5 50, 2 55 s，共30个循环,最后72延伸5 min. 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物. 检测培养上清中DA收集转染细胞上清，提取NA,以针对HBV前S/S基因的引物（sns: 5CGGGTCCCTATTCTGGAACAAG; antsen: 5ACTCAGTTTAAAGTATACCCA)PCR，扩增片段长度为200
11、bp，反映条件为94预变性5 in后开始循环,94 45 s, 55 1 ， 7 min， 共35个循环,最后7延伸mn. 设质粒pU19HV为阳性对照. 荧光定量PC检测上清中DN滴度取转染后8 h、转染后1 mo及转染后3 mo的细胞上清液(经PCR检测NA阳性）送第四军医大学西京医院临床免疫科,做荧光定量PR检测B DA滴度 操作环节按乙型肝炎核酸扩增荧光检测试剂盒阐明书进行. 成果鉴定为HV DA滴度106拷贝L为阳性，否则为阴性. 成果 , pcDN3和pcDNA3HBV的酶切鉴定pUC1HB双酶切后,电泳浮现两条带,片段大小约2900 bp（UC1）和960 b(3),单酶切条带均
12、在416与23130 b之间,pcDN3双酶切为50 p的片段. 连接产物双酶切后，电泳浮现两条带,分别为4 bp（cDA3）和960 bp(3HB),单酶切条带均在946bp 与23 10 bp之间，与预期成果相符（图1) ，且测序证明连接对的. 1，6:pcDA3经coR和Hd双酶切;2:C193HB经EcoR和Hnd双酶切; 3: C9HBV经EcR酶切; 4:193经Hd酶切; 5,: DA rkr Hid gst; 7: pcDNHBV经Eco和Hind双酶切; :pcDNA33HB经EcR酶切; 9: pcDA33B经Hid酶切. 抗G41细胞克隆的形成及筛选转染后4 k内对照组H
13、eG2细胞在G418的作用下所有死亡，同步转染pcDNA3HBV组pG2细胞阳性克隆形成. 挑取阳性克隆继续用G18筛选培养,建立了携带HBV全基因的细胞系. SA法检测HBsAg和HBeg体现转染pcDNA33HBV细胞组上清中HBsAg，HBeAg均阳性，而对照组ep细胞上清始终为阴性 在Hep2细胞中的体现转染cA33HV组细胞内cA为核浆型分布，以浆型分布为主. 未转染的pG2细胞未见染色(图2） S基因mNA体现的检测以转染细胞cDNA PR扩增actin，在20bp与00 bp间可见特异性条带,阐明cNA质量良好，转染pcDN33HB组细胞S基因引物扩增产物为50bp (图3). 对照组细胞未见扩增条带. 培养上清HB DN检测转染DA33HBV组细胞培养上清C扩增出10p的阳性条带,为HBV特异性前S/基因,与阳性对照相似对照组G2细胞未浮现阳性条带(图4). 荧光定量PC检测上清中A滴度转染pNA33组细胞培养上清中HBV滴度分别为8 h： 1108拷贝/L；1m: 107拷贝/L;3 mo： 107拷贝/. 3讨论 随着分子
