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1、2日小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549 , G418筛选获得稳定表达GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准 处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAK IS2000MM系统检测 肿瘤播散情况。一、实验材料准备1. BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20 g，无特定病原体（SPF）级饲 养。2. 肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基（美国GibcobrI公司）,5% CO237培养，常规传代
2、。3. 质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo（美国Gen script公司），携带Neomyci n耐药基 因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418（美国Promega公 司）800 & mu;g/ml初筛后200 ug/ml维持筛选。二细胞的转染1. 哺乳动物磷酸钙转染系统（美国Promega公司），按照操作指南将质粒pRNAT-U6/Neoo转入A549细胞，转染后2448 h荧光显微镜下观察转染效率。2.后培养液内加G418筛选获得稳定转染。3.利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性细胞。4. 1月后收获转染细胞，常规
3、传代培养，培养液中加G418(200 ug/ml)维持筛选。5. 测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染 后细胞的生长活性是否受转染的影响。6待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式V=1/2x长x宽计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差 别。三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立1. 取转染后细胞，用不含血清的RMPI 1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为 5x1060.2 ml 备用。2. 用0.5%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)(中国医药上海化学试剂公司腹腔注射麻醉裸鼠，用26号
4、针头吸取细胞悬液0.2 ml注射入裸鼠左侧胸腔，注射过程中注意控制刺入针头的深度。3. 整个操作过程在细胞收获后半小时内完成，严格遵循无菌原则。4注射后在KODAK IS2000MM下确认原位种植成功，注射部位为胸腔。5注射后继续饲养，隔天观察一次并记录体重。6. 当裸鼠出现精神萎靡、呼吸短促、弓背并明显消瘦，体重较注射Et减轻20%时，颈椎 脱位术处死裸鼠。7. 开胸观察，取出器官，用10%甲醛固定保存。四、检查项目1.转染后细胞荧光显微镜成像转染后24-48 h荧光显微镜下观察，确认转染成功。单克 隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。2活体GFP标记成像检测应用KODAK IS2000MM
5、进行活体荧光成像，确认注射部位为 胸腔，后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。3.解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经 详细解剖学检查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度连续切片，切片严格编号，奇数 号行HE染色，光镜观察，以初步确定转移灶。4. 免疫组织化学染色选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官，在HE染色确定转移灶位置的基础上，取相邻偶 数号码的切片进行免疫组化检测，CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062)，LRP鼠抗人单克隆 抗体(ZM . 0335)工作液，即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复 液、DAB Kit显色试剂盒(zU 9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。五、统计学处理细胞的生长活性和肿瘤体积x s表示，数值的比较采用方差分析。HE检测结果和活体 成像检测结果的比较用X2检验。采用SPSS13 . 0软件进行统计分析。注意事项原位种植法模拟肺癌发生的自然环境，是建立肺癌转移模型的最佳方法。肿瘤学研究中应 用最多的皮下种植法建立的模型只是局部包块而无远处器官的转移和播散，不出现肿瘤相 关症状。胸腔内原位种植法操作简便，重现临床NSCLC转移过程；GFP转入人肺腺癌 A549细胞对生长活性和致瘤性无影响，A549/GFP用于NSCLC转移模型结果可靠；借助于荧光显像设备，利用GFP的示踪功能可以非侵人性检测NSCLC转移。
