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1、植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103:庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50ug/mlo28C培养。3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3mlLB液体培养基中，220rpm28C振荡培养至0D600=0.5o2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10
2、min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5ml0.5MNaCI悬浮，冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用10020mMCaCI2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4C保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70C保存。使用时从一70C取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接转化农杆菌：1）50农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA0.11ug（510ul）,之后冰浴30min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37C水浴锅中水浴5min；
3、3）取出离心管，加入0.5mlLB,28C、220rpm振荡培养35hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28C条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan+Rif/Str；pTCK载体：Kan+Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28C振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan+Rif/Str；pTCK载体：Kan+Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5uL溶菌酶（50Ugml-1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）o
4、3）质粒酶切或PCR鉴定。6、三亲交配法：参考一：1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37C培养；（pEmu载体：50Ugml-1AMP；pK载体：50Ugml-1Kan；pTCK载体：50Ugml-1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37C培养；3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50ugmL-1Rif/Str的LB平板上28C培养；4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5）待三种菌生长到对数期时，各取50UL，混匀，涂布于无抗生素的LB平板上，28C培养过夜；6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的L
5、B液体培养基中，28C振荡培养24h；（pEmu载体：50Ugml-1AMP+50UgmL-1Rif/Str；pK载体：50Ugml-1Kan+50UgmL-1Rif/Str；pTCK载体：50ugml-1Kan+50ugmL-1Rif/Str）7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28C培养至长出单菌落；（pEmu载体：50ugml-1AMP+50ugmL-1Rif/Str；pK载体：50ugml-1Kan+50ugmL-1Rif/Str；pTCK载体：50ugml-1Kan50ugmL-1Rif/Str）8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量
6、提取质粒DNA进行PCR鉴定。10）将阳性单菌落再次划线纯化。三亲交配法：参考二：1）从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28C,200rpm培养24h;2）从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37C，250rpm培养约8h;3）从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37C,250rpm培养约8h;4）分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28C培养过夜；5）用接种环将长
7、出的菌落转接到含有Kan50ug/ml,Str25ug/ml和Rif25ug/ml的LB平板上，28C培养过夜;同时各取1,2,3步骤中的菌液100u分别涂布于含有三种抗生素的LB平板上，作为对照。注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用PCR鉴定。（PCR鉴定时要做好阴性对照。一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性1）、利福平，溶于
8、甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度50100L。2）、利福平（Rif）先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于一20度保存。工作浓度50ug/ml4）、链霉素用水融解至浓度为10mg/ml后于一20度保存。工作浓度50ug/ml5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。抗生素储存液工作浓度浓度（mg/ml）保存条件严紧型质粒（ug/ml）松弛型质粒（ug/ml）
9、氨苄青霉素50（溶于水）-20C2060羧苄青霉素50（溶于水）-20C2060氯霉素34（溶于乙醇）-20C25170卡那霉素10（溶于水）-20C1050链霉素10（溶于水）-20C1050四环素5（溶于乙醇）-20C10507、水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75%酒精浸泡Imin）,再于0.1%升汞中浸泡15min（或再转入20%的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min）,超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28C暗培养45d，切除胚根，继续培养12-15d,
10、待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。28C暗培养至长出愈伤组织。选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）8、根癌农杆菌的培养平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50ugml-1AMP+50ugmL-1Rif/Str；pK载体：50ugml-1Kan+50ugmL-1Rif/Str；pTCK载体：50ugml-1Kan+50ugmL-1Rif/Str），28C摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗
11、生素）培养8小时左右至0D600为0.5左右。4C，5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100uMAS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uMAS的AAM液培中，28C摇床上培养至OD600=0.5。9、愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的23mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27C暗培养34天。生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜
12、的AAM农杆菌菌液（含100uMAS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28C（或25C）暗培养23天。11、洗除农杆菌共培养23天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mgL-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止3050min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基
13、上，置25C培养箱内暗培养。11、抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。培养48周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织,转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。（N6-S1：N6，100mgL-1G418,250mgL-1羧苄青霉素）（N6-S2：N6，50mgL-1G418，125mgL-1羧苄青霉素）12、抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈
14、伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26C暗培养1周，然后转入25C光照培养（12h光照，12h黑暗）。13、转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。（筛选4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进行分化出苗，光照24h/d,再生的小苗长至2-3cm左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高710cm时，打开瓶盖于温室中炼苗57天,待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。注意保湿，以提高移栽成活率。筛选剂类型：在植物基因转
15、化中，外源基因稳定整合的频率低。如何选择适当的筛选标记以准确、有效地区分转化与非转化细胞，产生选择压力，使未转化细胞不能生长，且不干扰细胞的正常生长与植株再生是转化成功的重要环节之一。1、较早应用于水稻转化实验的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）,对卡那霉素具有抗性。但由于水稻对卡那霉素具有天然抗性，没能广泛应用。G418是一种与卡那霉素饵近的氨基糖苷类抗生素，不能被新霉素磷酸转移酶激活，用它作选择标记比卡那霉素更有效，而且再生绿苗频率更高。2、现在bar当作选择基因也已被用于水稻遗传转化研究（Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。）。3、潮霉素磷酸转移酶（HPTII）基因是另一应用广泛且更有效的标记基因，它具有对潮霉素的抗性，用潮霉素可以明显区分已转化和未转化的组织。不同选择剂应用浓度和选择时间应根据不同材料的具体情况而定。马炳田等报道了通过调节潮霉素的使用浓度，在抗虫转基因水稻研究中提高筛选率，结果表明：筛选时潮霉素使用浓度为2030mg/L；分化时潮霉素使用1525mg/L，可得到较高的抗性愈伤组织筛选率和绿苗分化率。总结分析：1、pEmumcsN载体：载体带有Amp抗性基因，在大肠杆菌和农杆菌中可用Amp作抗性筛选。但是载
