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1、第一章1：与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 2：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 建立相应的可靠分析测定方法，是制备生物大分
2、子的关键。 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 产物的浓缩，干燥和保存。3：分析测定的方法主要有两类： 即生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多
3、用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。4：生物大分子的分离纯化方法有多种，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： 利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； 将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。 5：需了解的生物大分子物理、化学性质,主要有： 1、在水和各种有机溶
4、剂中的溶解性。 2、在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 3、固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4、各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 5、其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 6、对其他生物分子的特殊亲和力。6：为什么要细胞破碎细胞是生物体结构和功能的基本单位，通常人们所需的物质有些分泌于细胞外，如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌细胞外的培养液中，用通常的溶剂可自接提取；有些则存在于细胞内，这类酶又有游离酶和结合酶之分，前者游离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结
5、合(如氧化还原酶和有机磷水解酶等)。欲提取存在于细胞内的物质时、必须把细胞破碎。细胞破碎的阻力跟细胞结构有关。7：纯化方案 是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法有机地互补联合、灵活应用的总称。它既是从各类材料中提取分离有效成分的前提，又是成功地达到纯化目的之保证。8：纯化方案的评价对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价，而这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出。其方法是，对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测定，并将各自的比活力(活力单位数/毫克蛋白)、纯化倍数(每步的比活力粗抽提液的比活力)和收得率计算出来。视纯化倍数的大
6、小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值。一般认为，凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的，反之，则应用价值不大。实践中对纯化倍数和收得率的要求是依据材料来源的难易而变化的。若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数(见沉淀法)。9：蛋白质纯度的鉴别标准蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法等。蛋白质纯度的鉴别有下列几点要求： 蛋白质在不同pH条件下的电泳，均呈现一条分离区带。 蛋白质等电点聚焦电泳呈现一条分离带。 经纯化后的蛋白质，应不失其生物活性。 纯的蛋白质在超速离心力场
7、中，以单一的沉降速度运动。选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定。10：蛋白质含量的测定 蛋白质含量的测定是分离纯化工作中的重要部分。蛋白质测定的方法有： 紫外吸收法 利用芳香族氨基酸在280nm的吸收作用。 福林酚法（Folin法） 与福林试剂反应产生蓝色。 染料结合法（Bradford法）与考马斯亮蓝G-250反应产生蓝色。 固体样品中蛋白质含量的测定，一般用凯氏定氮法。11：核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280）等方法。同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方法才能确定。1
8、2：核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/L NaCl溶液而不溶于0.14mol/L NaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/L NaCl溶液而不溶于1mol/L NaCl溶液的性质，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。13：蛋白质的去除可以选择去污剂法或有机溶剂法。去污剂法是利用SDS等阴离子去污剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为
9、溶解度小的钾盐而同时沉淀。有机溶剂法是利用酚、氯仿的混合液作蛋白质的变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。最后利用乙醇或异丙醇讲核酸沉淀离心收集即可。14：从RNA除去混杂的DNA，可用DNAase将DNA降解掉。从DNA中除去混杂的RNA，可用RNAase将RNA降解掉。15：核酸样品进行精提纯，一般常用超离心、电泳、柱层析等方法。超离心包括速度区带离心、沉降平衡超离心。电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖电泳。 前者凝胶孔径小，适合分离1000
10、个核苷酸以下的核酸分子。后者孔径大，适合分离较大的核酸分子。柱层析主要有凝胶过滤柱层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱层析。第二章1: 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。2: 硫酸铵盐析固体法盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）、计算法X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0 515，20 513 A为常数 0 0.27 20 0.29P2、P1为初
11、始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）、查表法饱和溶液法V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)；V0表示原来溶剂的体积(m1)；S1和S2含义同上；S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。3：有机溶剂沉淀法的优点是： 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。4：有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法的注意事项在这里同样适用。此外，还有几点需
12、要指出： (1)低温下操作：由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶剂预冷至一1O，而且整个操作要在低温下进行。 (2)中性盐作用：加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果。但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。因此，用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。 (3)多价阳离子作用：有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等)能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益第三章1：色谱法的优点和缺点
13、色谱法的优点分离效率高。几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到分离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。分析速度快。一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。检测灵敏度高。随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10-9g 级的微量物质。如采用预浓缩技术，检测下限可以达到 10-12g数量级。样品用量少。一次分析通常只需数纳升至数微升的溶液样品。选择性好。通过选择合适的分离模式和检测方法，可以只分离或检测感兴趣的部分物质。多组分同时分析。在很短的时间内（20min左右），可以实现几十种成分的同时分离与定量。易于自动化。现
14、在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。色谱法的缺点定性能力较差。为克服这一缺点，已经发展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。 2：按层析过程的机理分类：分配层析：溶解度离子交换层析：带电性，静电引力吸附层析：吸附力亲和层析：配体专一性凝胶层析：分子大小3：按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。 4：吸附剂的选择 共性：吸附剂应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 个性：在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。否则反之。要选择一个理想的吸附剂必须经过多次试验才能获得。5：吸附剂的性质前处理：先过筛，除去大的颗粒，或者用悬浮法除去细小颗粒，然后用酸、碱等溶液浸泡，接着用沸水煮，清水洗，最后用有机溶液如甲醇处理，得到既无
