一种黑曲霉高耐热β

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1、一种黑曲霉高耐热卩-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析韩冰;王施岚;德青美朵;沈微;陈献忠;樊游【摘要】通过RT-PCR克隆、鉴定了黑曲霉中编码1种葡聚糖酶基因eglA6,所编 码的重组酶蛋白命名为AneglA6.通过密码子优化提高了 AneglA6在巴斯德毕赤 酵母中的表达水平,对重组酶进行纯化并研究酶学性质,重组酶表观分子量约为52 ku以大麦葡聚糖为底物时，重组酶比酶活为12 450.6 U/mg;以CMC-Na为底物时, 酶活是1 645.7 U/mg;以酵母葡聚糖等1,3-葡聚糖为底物时，重组酶未表现出明 显的活力重组酶最适温度为75C,在75C和70C下半衰期分别为1.9和

2、4.6h.AneglA6最适pH为4.0,在pH 3.0 5.5范围内具有酶活力的50%以 上AneglA6是一种在酸性和高温条件下有较高活力和稳定性的耐热内切卩1,4-葡 聚糖酶.期刊名称】 食品与发酵工业年(卷),期】 2018(044)011【总页数】8页(P55-62)【关键词】内切-P-1,4-葡聚糖酶;黑曲霉;酶学性质;耐热【作 者】 韩冰;王施岚;德青美朵;沈微;陈献忠;樊游【作者单位】 江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大 学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育 部重点实验室,江苏无锡,214122

3、;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无 锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学, 工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中 文P-葡聚糖是大麦、高粱等农作物胚乳细胞壁的重要成分，是一种具有高粘度的生 物大分子p-葡聚糖酶主要通过对P-葡聚糖的降解以降低底物黏度，在啤酒和饲 料工业中有重要的应用价值。目前，我国葡聚糖酶的工业化生产菌种主要是里氏木 霉(Trichoderma reesei)1，其所产p-葡聚糖酶的最适温度在60 C左右，最适 pH在4.8 5.5。黑曲霉(Aspergillus niger)和

4、淀粉液化芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)来源的葡聚糖酶也有一定的应用，前者最适pH在4.06.0, 最适温度一般在50 60 C2;后者最适pH在6.0左右，最适温度为50 C3。这些工业化生产菌种具有较高的发酵水平，但产品在耐热性和耐酸性方面还不能充 分满足啤酒和饲料工业的需要4。在啤酒酿造中，葡聚糖酶主要在糖化工段中使 用，麦汁糖化过程的温度有时可以达到65 70 C4。在饲料加工中，虽然P-葡 聚糖酶在37 C左右的中性环境发挥作用，但在此之前其必须要耐受饲料生产过程 中造粒工段的高温环境和动物胃部的酸性环境。饲料造粒工段的温度一般要达到 75 85 C,

5、甚至更高，而成年动物胃部pH 般在23。因此耐酸和耐热依然是 开发饲料用P-葡聚糖酶的重要目标。自然界中许多微生物可以产生内切葡聚糖酶， 其中相当一部分已实现了异源表达5。在这些葡聚糖酶中，细菌来源的葡聚糖酶 的热稳定性普遍低于真菌，而且最适pH值普遍中性5。丝状真菌来源的葡聚糖 酶大多有一定的耐酸性4-11，这可能是其在应用上的一个优势。嗜热真菌来源的 葡聚糖酶在耐酸性和耐热性方面均有一定的优势，因此受到研究者的关注。嗜热真 菌Talaromyces emersonii来源的葡聚糖酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物 的最适温度高达90 C,最适pH 4.5，在80 C下酶活半衰期大约为50

6、m 12, 可能是目前已发现的耐热性最高的真菌葡聚糖酶。嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophile)葡聚糖酶在毕赤酵母中的表达产物的最适温度为70 C,最适pH 7.013。李一男等14进一步筛选到这种酶的一个耐酸性突变体，其最适pH降 至5.5。耐酸性是黑曲霉重要特点之一,是糖化酶、537酸性蛋白酶等多种耐酸性 酶制剂的生产菌。2007年，黑曲霉CBS 513.88基因组序列被公布15，这些信 息为研究人员发掘新型葡聚糖酶提供了有利条件4。该文前期对黑曲霉基因组中 可能编码葡聚糖酶的多条基因逐个进行cDNA克隆和异源表达，并初步检测其酶 学性质,以筛选性能优良的葡聚糖酶及其

7、编码基因。结果发现,黑曲霉基因组中一 条被标注为内切P-1,4-葡聚糖酶A的基因(GenBank登录号：XM_001389540), 其cDNA表达产物的耐热性和耐酸性明显高于其他基因的产物，而这条基因的高 效表达和重组酶酶学性质尚缺乏研究报道,该文主要对该基因在巴斯德毕赤酵母中 的表达及重组酶性质进行研究。1 材料与方法1.1 菌株和质粒黑曲霉(A. niger) CICIM F0510由江南大学教育部工业微生物资源信息平台提供; 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和表达载体pPIC9K购自Invitrogen公 司，本文构建的重组菌巴斯德毕赤酵母pPIC9K-eg

8、lA6b HB133已保藏在中国高 校工业微生物资源信息平台，保藏编号为CICIM Y1489。1.2 主要试剂UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒购自上海生工 生物工程技术服务有限公司；重组DNA所使用的限制性核酸内切酶等购自大连宝 生物工程公司；表达载体构建时采用Prime star进行PCR扩增以保证PCR产物 5端为平末端;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、大麦葡聚糖P-Glucan (barley)、燕麦 葡聚糖 p-Glucan(oat)、地衣多糖(lichenan)、酵母葡聚糖 p-Glucan(yeast)、茯 苓多糖(pachyman)和凝

9、结多糖(curdlan)均购自Megazyme公司；G418购自 Invitrogen公司，酵母氮基YNB购自Difco公司，该产品中不含组氨酸。其他试 剂均为国产分析纯试剂。引物、全基因合成和DNA测序均委托上海生工生物工程 技术服务有限公司完成。1.3 黑曲霉葡聚糖酶基因的克隆与载体构建1.3.1黑曲霉内切葡聚糖酶cDNA基因的克隆根据美国国家生物技术信息中心(NCBI) GenBank数据库公布的黑曲霉CBS513.88基因组序列中一条标注为内切葡聚糖酶A的cDNA序列(登录号： XM_001389540)，设计引物扩增目的基因，引物如下：Peg01 5-ATGAAGACTCTCTCCC

10、TTG-3；Peg02 5-GAGATATAGCTAACC-3。以UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取黑曲霉CICIM F0510的总RNA , 以一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和PCR扩增。电泳分离并回收PCR扩增产物 中1.2 kb左右的片段，与pMD18T-simple连接，连接物转化大肠杆菌JM109 , 任取4个转化子提取质粒后送上海生工生物工程公司测序，测序结果显示其中3 个质粒为插入了葡聚糖酶编码基因的重组质粒， 3个转化子中插入片段的序列完全 致。插入片段的序列已登录GenBank，登录号为：MG913988。任取其中1个 质粒命名为pMD-eglA6用于表

11、达载体的构建。1.3.2 重组表达载体的构建 根据所扩增葡聚糖酶基因的序列，设计引物如下：Peg03 5-AGTCCGAGGGCTA AGC-3;其中，引物Peg03与eglA6基因成熟肽编码区5端一致，Peg04下划线部分与 eglA6基因编码区3端序列互补。以pMD-eglA6为模版，用引物PegO3和 PegO4扩增目的基因，扩增产物纯化后用Not I单酶切，与经SnaB I和Not I 双酶切的表达载体PPIC9K连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞。任取 转化子提取质粒，用引物Peg03和Peg04进行PCR验证，其中能获得大小约为1.1 kb的扩增产物的质粒为插入了目的片

12、段的重组质粒。由于重组质粒构建时目 的片段的5端是未经酶切，直接与载体上由SnaBI酶切产生的平末端连接，这种 连接有可能出现目的片段5端部分碱基的丢失，因此任选了 10个重组质粒进行测 序。结果发现有3个重组质粒所含片段与预计的扩增序列完全一致，即载体中的 插入片段序列均与eglA6基因成熟肽编码区完全一致。任取其中1个质粒命名为 pPIC9K-eglA6，用于重组毕赤酵母的构建。按照巴斯德毕赤酵母甲醇氧化酶基因密码子使用规律对eglA6基因成熟肽编码区 进行优化，优化后的基因命名为eglA6b并登录GenBank，登录号为： MG913989。基因eglA6b由上海生工生物工程技术服务有限

13、公司合成并与载体 pUK连接，重组载体命名为pUK-eglA6b。根据eglA6b的序列设计引物如下：Peg05 5-TCTCCAAGAGCCAAGAG-3；Peg06 5-ATGCGGCCGCTTACAGACACTGAGAG-3。以质粒pUK-eglA6b为模板，采用PCR扩增eglA6b基因成熟肽编码区，采用与 上述pPIC9K-eglA6相同的方式构建重组质粒，并测序验证获得插入片段序列与 eglA6b成熟肽编码区完全一致的重组质粒，所获得的重组质粒命名为pPIC9K- eglA6b。1.4黑曲霉葡聚糖酶基因的表达、重组酶纯化与酶活测定1.4.1 重组巴斯德毕赤酵母的构建用Bgl 口分别

14、酶切重组质粒pPIC9K-eglA6和pPIC9K-eglA6b获得线性化的重组 质粒，经过PCR纯化试剂盒纯化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化物 涂布不含组氨酸的MD平板，30 C恒温培养3 d，转化子形成菌落后任选20个 菌落划线分离，对应每个转化子在分离平板上任取3个单菌落的上清液进行摇瓶 发酵，取平均值分析转化子酶活。1.4.2 重组毕赤酵母的诱导表达重组毕赤酵母的诱导表达的方法以及所使用的培养基MD、BMGY、BMMY等均与文献16一致。1.4.3 葡聚糖酶的纯化与酶活测定粗酶液用0.22 pm微孔滤膜过滤除去杂质，pH 5.5,5 mmol/L Tris-HCI缓冲液平

15、衡后上样于1 mL QHP阴离子交换柱，用含1 moI/L NaCI的pH 5.5 , 5 mmol/L Tris-HCI缓冲液线性洗脱，进行离子交换层析，收集活性峰。纯化产物 用SDS-PAGE电泳验证纯化效果，Bradford法测定蛋白含量，纯酶用于酶学性质 分析。参考YAN等17啲方法采用DNS法测定内切葡聚糖酶的活力。取0.5 mL适当稀 释的酶液，加入4.5 mL , 1%底物（0.05 mol/L柠檬酸-0.1 mol/L Na2HPO4缓冲 液配制，pH 4.0） ,75 C下反应20 min，加入7.5 mL DNS试剂，煮沸15 min , 在540 nm波长下测定吸光值。如

16、无特别说明，检测底物均为大麦葡聚糖。酶活单位定义：在相应条件下，每分钟分解大麦葡聚糖或其他底物产生的还原糖， 其还原力相当于1 pmol葡萄糖所需的酶量，用1 U表示。1.5 酶学性质的分析1.5.1最适pH值和pH稳定性的测定分别配制pH为3.0 7.0的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液，在75 C下，测定酶在不 同pH值缓冲液中酶活力，以最高酶活性为100%，计算不同pH值条件下相对活 性。在50 C将酶液分别在pH 27缓冲液中保温，每隔1 h取样，在最适条件下测定酶活，以未经处理的原酶液活性为100%，分析重组酶的pH值稳定性。1.5.2 最适温度及温度稳定性的测定在pH值4.0条件下,55-85 C范围内，间隔5 C测定不同温度对酶活力的影响