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1、上海荣盛生物药业有限公司 SOP-ZL-440-03SDS-PAGE法蛋白纯度检验操作规程SOP起草人/日期：审核人/日期： 替代：QA审核/日期：批准人/日期：生效日期：分发部门：质保部、QC实验室1 目的：建立一个蛋白纯度的检验操作规程，规范检验操作2 范围：用于蛋白纯度的检验3 职责3.1 QC检验员：根据该检验操作规程进行正确操作3.2 QA人员：根据该检验操作规程对实验及实验记录的监督管理4 内 容4.1 仪器设备：垂直板电泳槽装置，烧杯（25ml，50ml，100ml），移液器（10ul，200ul，1ml）稳压仪，摇床，凝胶成像系统。4.2 试剂：4.2.1 分离胶缓冲液 称取三
2、羟甲基氨基甲烷18.15g，加水70ml，用盐酸调pH值至8.8，加纯化水稀释至100ml。4.2.2 30%丙烯酰胺溶液 称取丙烯酰胺30.00g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺0.80g，用纯化水稀释至100ml（避光保存）。4.2.3 10%过硫酸铵溶液 称取10.00g过硫酸铵，用纯化水定容至100ml。4.2.4 浓缩胶缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷6.00g，加水70ml，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100ml。4.2.5电泳缓冲液（10） 称取三羟甲基氨基甲烷30.00 g，甘氨酸144.00 g，十二烷基硫酸钠10.00g，加水稀释至1000ml。（临用前10倍稀释）4.2.6
3、供试品缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 0.303g，溴酚蓝2mg，十二烷基硫酸钠0.80g，甘油4ml，量取HCl0.189ml，加水溶解并稀释至10ml。此溶液用于非还原型SDS-PAGE法蛋白纯度检测，如用于还原型SDS-PAGE法，则再加-巯基乙醇2ml。4.2.7染色液 称取考马斯亮蓝R250 2.50g，加水200ml溶解后，加入95%乙醇500ml和冰醋酸100ml，加水定容至1000ml。4.2.8脱色液 量取95%乙醇55ml，冰醋酸75ml，加水1000ml混匀。4.3 检验步骤4.3.1 供试品制备 将供试品用纯化水稀释到1mg/ml，取20ul于0.5ml具盖离心管中，加入
4、等体积的供试品缓冲液，充分混匀，100水浴加热5分钟。 4.3.1 安装垂直玻璃板，在两玻璃板的间隙中注入纯化水检查是否漏液。4.3.2 制备分离胶溶液 按下表所示，在烧杯中依次加入各试剂，在加入TEMED后立即快速悬动混合物并灌灌入两玻璃板间隙中至一定高度，在其上覆盖一层水溶液，室温下待分离胶聚合（室温不同，聚合时间不同）。 凝胶种类分离胶溶液浓缩胶溶液凝胶浓度12%7.5%5%凝胶体积15ml10ml15ml10ml7.5ml7.5ml6ml5ml3ml30%丙烯酰胺6.004.003.52.331.751.751.000.830.50分离胶缓冲液3.752.503.752.51.8751
5、.875/浓缩胶缓冲液/1.501.250.75纯化水5.253.57.755.173.8753.8753.402.831.7010%过硫酸铵0.050.050.050.050.0250.0250.060.060.03TEMED0.010.010.010.010.0050.0050.0060.0060.0034.3.3 制备浓缩胶溶液 待分离胶溶液聚合后，弃去上层水溶液灌入浓缩胶溶液（配方见上表），立即插入样品梳，注意避免起泡出现。4.3.4 上样 待浓缩胶聚合完全后（约30min），将凝胶固定于电泳装置上，小心拔出样品梳，在电泳槽内注满1电泳缓冲液，用移液器在样品孔中加入制备好的供试品溶液和
6、蛋白Marker 各10ul。4.3.5 电泳 将电极导线正确连接至电极，接通电源，25mA恒流电泳，当溴酚蓝移动到胶的底部时，关掉电源，停止电泳。4.3.6 染色 电泳结束后，将玻璃板从电泳装置上卸下，取出带胶玻璃板，轻轻撬开玻璃板取出凝胶置于盛有染色液的器皿中（染色液需浸过胶面），置摇床上染色至少30分钟。4.3.7 脱色 弃去染色液，将凝胶放入脱色液中，置摇床上脱色至背景蓝色基本褪尽为止。4.3.8 凝胶拍照及结果分析：将脱色完全的凝胶放入凝胶成像系统中拍照，保存实验数据，并使用图像分析软件对目的蛋白进行纯度分析。5 相关文件5.1 中华人民共和国药典2010年版三部6 附件6.1 SDS-PAGE法蛋白纯度检验记录6.2 溶液配制记录7 文件修订历史版本号修 订 内 容执行日期01新定第 3 页 共 3 页
