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1、几种常用的染料1. Calcein klsen：钙黄绿素（活菌染色）Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(
2、钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm
3、，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。2. PI：碘化丙啶（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增）荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物
4、，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。3. PMA（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增） PMA(propidium monoazide)，叠氮溴化丙锭，PMA?是一款具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料。染料自身的荧光非常微弱， 但是结合核酸后荧光信号很强。PMA 倾向于结合dsDNA，PMA上的叠氮基团生成高反应性的nitrene基，很容易的在结合部位与碳氢化合物
5、部分地结合生成稳定牢固的共价氮碳键，从而形成稳定的DNA修饰。PMA完全不能通透细胞膜，因此它只能选择性的修饰死细胞“暴露”的DNA(细胞壁和细胞膜已破损的细胞)。这一特性使得它可以和定量RT-PCR联合使用，进行选择性的扩增活细胞DNA，不扩增死细胞DNA。例如，许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态（Viable but nonculturable state, VBNC）。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检，利用EMA（Ethidium Monoazide Bromide）或者PMA（propidium monoazide）联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增，该方法结合了
6、EMA（PMA）选择渗透性和PCR特异性，作为一种区分细胞死活的方法，可以有效检测细菌VBNC细胞。4. EMA（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增） 在食品、药品、水环境、医疗样品等微生物学检验过程中，传统PCR技术无法区分样品中的死菌与活菌，因为死菌DNA在PCR检测中也能扩增出目的基因，从而使检测结果出现大量的假阳性，干扰了检测的真实性。叠氮溴化丙锭（PMA）和叠氮溴乙锭（EMA）是一类新型的核酸结合染料，它们可以穿过受损的细胞膜或死菌细胞膜进入细胞内，与基因组DNA发生共价交联反应，从而能阻止样品中死菌DNA进入PCR扩增环节。而PMA或EMA都不能透过完整未受损的活菌细胞膜，活菌DNA不受其影响，从而让样品中活菌DNA得到PCR扩增。通过这种方法（PMA-qPCR、EMA-qPCR）或其他方法（PMA-LAMP、EMA-LAMP），最终使死菌DNA在检验过程中被选择性的剔除，大大提高了活菌检测的准确性。
