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1、改进的反向斑点杂交方法林炳生;张太松;胥顺;董瑞华;陈华云;李明;程钢【摘要】目的改进反向斑点杂交的操作方法，探索更为简便快捷的实验流程.方法 优化杂交液H的组分，使用HPV基因分型、阳地中海贫血基因突变和HBV基因分 型三个试剂盒验证改进的实验方法.结果HPV基因分型、阳地中海贫血基因突变和 HBV基因分型试剂盒的实验结果证实,使用优化后的杂交液H,链霉亲和素过氧化物 酶在杂交温度能够有效地与生物素结合，试剂盒的灵敏度不受影响且膜条的背景低. 结论改进的反向斑点杂交方法不影响试剂盒的灵敏度,并且操作简便、实验时间短、 实验结果背景低.【期刊名称】分子诊断与治疗杂志【年(卷)，期】2011(0
2、03)001 【总页数】4页(P18-21) 【关键词】反向斑点杂交;链霉亲和素过氧化物酶;操作简便 【作者】林炳生涨太松;胥顺;董瑞华;陈华云;李明;程钢【作者单位】中山大学药学院广东广州,510006;中山大学达安基因诊断中心广东, 广州,510665;中山大学达安基因诊断中心广东广州,510665;中山大学达安基因诊 断中心广东广州,510665;中山大学药学院广东广州,510006;中山大学达安基因诊 断中心广东广州,510665;中山大学达安基因诊断中心广东广州,510665;中山大学 达安基因诊断中心广东广州,510665;中山大学药学院广东广州,510006;中山大学 达安基因诊
3、断中心,广东,广州,510665【正文语种】中文反向斑点杂交（reverse dot blot , RDB ）技术是基于 PCR-ASO （ polymerase chain reaction & allele specific oligonucleotide）技术发展起来的，Saiki 等1 在1989年首次报道了这一技术的应用。RDB是将探针固定在尼龙膜上，然后与 游离的靶基因杂交，因此能够进行多个靶基因并行检测，并且可用于批量检测。除 此之外，现有的RDB技术还具备以下特点：有效区分单核苷酸多态性：张太松 等2研究者报道，运用RDB技术进行HBV基因分型检测，实验结果与测序结果 的符合率
4、达到97.5% ；高灵敏度：利用尼龙膜表面的羧基（COO-）与探针的氨 基（NH2-）共价结合3，提高探针的固定效率并增加探针的有效密度，检测的灵 敏度可达到103IU/mL2；易于推广：显色的底物形成蓝色基团，实验结果使 用普通的光学扫描仪即可保存实验图像，配套的分析软件分析得出准确的判读结果。 目前，基于RDB技术的系列产品在临床已经得到广泛的应用，如Innogenetic的 INNO-LiPA HBV基因分型，中山大学达安基因股份有限公司的HPV基因分型。 但是RDB技术也存在明显的不足：操作步骤繁琐，实验时间较长等。针对这些不 足我们进行了深入的研究，提出杂交方法，从而简化实验流程并缩
5、短实验时间，对 RDB产品的推广有重要意义。1.1标本来源实验使用的标本均来源于广州达安临床检验中心，其中，HPV标本为棉拭子 阳性27例，HPV阴性30例 邙-地中海贫血标本为EDTA抗凝全血阳性60 例，阴性50例；HBV标本为血清一一阳性标本50例，HBV阴性80例。1.2试剂中山大学达安基因股份有限公司的3个RDB产品，分别为HPV基因分型检测试 剂盒（PCR-反向斑点杂交法）邛-地中海贫血基因分型检测试剂盒（PCR-反向斑 点杂交法）和HBV基因分型检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）。1.3方法1.3.1 DNA提取：按试剂盒说明书提供的试剂和要求操作，提取的DNA存放于4 C1.
6、3.2 PCR扩增：按试剂盒说明书的要求操作并在ABI9700完成扩增。1.3.3 PCR产物杂交：试剂盒提供的膜条，在其右边的编号框内编号。PCR扩增产 物98 C热变性5 min，取出后迅速插入碎冰中。5 mL EP管中加入3.54.5 mL 杂交液和全部的PCR产物，并在每一个EP管中同时放入两张膜条。膜条的正面 朝外而背面贴在一起。其中，HPV基因分型的杂交温度为45 C，B-地中海贫血 基因分型和HBV基因分型杂交温度为42 C。以B-地中海贫血反向斑点杂交（RDB ）基因分型检测试剂盒为例，在完成第一步的杂交之后，做两种不同杂交 方法的比较，具体的操作步骤如下表1。1.3.4实验结
7、果分析达安膜条斑点分析识别系统（软著登字第：100565号）分析采集的电子图像并直 接输出检测结果。2.1 HPV实验结果经改进前实验确认的HPV18型的标本，用荧光定量试剂盒标定病毒拷贝数为 5x107,对此标本进行10倍的梯度稀释，依次为5x106,5x105,5x104, 5x103,5x102，对应的编号为712，对应的实验结果如下图1所示。该实验结果经达安膜条斑点分析识别系统分析，两种方法的711判读结果均为 HPV18型，而17的4号位点信号值为9.81，而27的4号位点信号值为 30.14，根据我们先前的研究，4号位点的临界值为40（数据没有显示），也就是 说，5x102实验结果
8、为阴性，5x1035x107浓度的标本改进前与改进后的方法 得到的判读结果是一致的。改进前与改进后的实验图像经达安膜条斑点分析识别系统分析，两种不同的方法的 判读结果(27例阳性和30例阴性共57例)是一致的。实验的27例阳性标本中，单一例别感染，出现一例的型别有11型，31型，68 型，出现2例的有18型，66型，出现3例的有16型；其它的均为两个或两个以 上混合感染，出现一例的有6&11型，6&58型，11&31型，52&58型， 33&52型，39&Cp8304型，出现两个的有6&16型，6&31型。2.2 B-地中海贫血基因分型实验结果改进前与改进后的实验图像经达安膜条斑点分析识别系统
9、分析，两种方法判读结果 完全一致；膜条1号与4号，2号与5号及3号与6号的PCR产物的杂交条件相 同，因此将改进前与改进后的阳性位点积分光密度信号值作配对检验，统计软件 SPSS13.0计算结果为P=0.268，即：两种方法得到的结果在统计学上没有显著性 差异。对比结果如下图3所示，积分光密度信号值见表2。试验的60例阳性标本，检测结果为：CD41/42 (-TCTT )杂合子25例，IVS2- 654 (C-T)杂合子 14 例，CD17 (A-T )杂合子 9 例，TATA28 (A-G )杂合 子7例，CD71/72 (+A )杂合子3例邛E杂合子(G-A)1例，及CD41/42- IV
10、S2-654双重杂合子1例。不同突变类型的比例分布与最近的研究结果相近4。2.3 HBV基因分型实验结果HBV基因分型的显色时间比试剂盒说明书10 min延长至15 min，改进前与改进 后的实验图像经达安膜条斑点分析识别系统分析，两种方法判读结果完全一致；但 改进前的实验方法在延长显色时间之后膜条背景明显加深，而改进后的实验方法却 仍然能够保持清晰的实验背景。对比结果如下图3所示。试验的50例阳性标本中，检测结果为：B型20例，C型29例，D型1例。RDB的实验原理从表1可以看出由四个步骤组成：第一步是PCR产物与固定在尼 龙膜上的探针配对结合，这一过程是非选择性的；第二步是将非特异结合的P
11、CR 产物洗脱下来，这一步需要在预热到杂交温度的杂交液II中完成；第三步是链霉 亲和素过氧化物酶与生物素结合，通常要求在室温完成；第四步是底物显色。我们 对RDB技术的改进体现在将第二步和第三步同时进行从而实现操作流程的简化。此项改进必须确保链霉亲和素过氧化物酶在杂交温度下活性不受影响。HPV基因分型试剂盒和P-地中海贫血基因分型试剂盒的比对结果证实：链霉亲和 素过氧化物酶在杂交温度下能够有效地与生物素结合，试剂盒的灵敏度和信号值的 稳定性不受影响。试剂盒的杂交液II，根据链霉亲和素过氧化物酶的特性改进了试 剂组分和缓冲条件，从而延长了链霉亲和素过氧化物酶的温度耐受性；HBV基因 分型对比结果
12、显示，改进后的实验方法获得背景更低的实验结果。在链霉亲和素过氧化物酶结合过程中，除了与生物素结合之外，还在膜条表面发生 物理吸附。因此在结合之后需要通过洗涤除去膜条表面附着的链霉亲和素过氧化物 酶。洗涤的过程使链霉亲和素过氧化物酶游离出来，游离的速率遵循无规则的布朗 运动，温度越高布朗运动越剧烈，因此高温洗涤能够加快附着链霉亲和素过氧化物 酶的游离，从而使杂交本底得到有效的控制。HBV基因分型的实验结果就证实了 改进后的实验方法延长显色时间并不影响实验背景及结果的判读，但仍建议严格按 照试剂盒说明书要求进行操作。将链霉亲和素过氧化物酶加入预热到杂交温度的杂交液II中，不仅解决了操作繁 琐的问题
13、，同时减少了非特异性的物理吸附，从而保证杂交结果的背景清晰。更重 要的是，简化了实验操作并明显的缩短了实验的时间，为反向斑点技术的推广奠定 了基础。这一实验方法已经申请了专利56。感谢广州达安临床检验中心邓文国老师、熊金光老师和朱永强老师在临床标本收集 中给予的帮助。【相关文献】s Saiki R K、wa-sh P s、Levenson CH、ei aL Genetic ana-ysis of amp=fied DNA wlh immob 三 zed sequencespecwc o=gonuc-eoM-B- 2。9、3。(4= 42432 sZhang Y、Coyne M Y、W三 S G
14、、ei aL smg-ebase muiauona- ana-ysis of cancer and genetic diseases using membrane bound modified o-igonuc-eoudesuLNUC-QC Adds Res、1991、19(14 39291393W-4J Zhang C M、Wang Y、Gao L s、ei a- Mo-ecu-ar epidemioogy mvesugac+.on of E iha-assemia 5 Zhongshan Chy、Guangdong province、peop-e-s Repub=c of chmas Hemogobm 2010、34(1= 5560，笆浦碧密SI折呆写、粮善浮序昏团回净壮汨&氓讲对同国PL-B-画卅座研和切 2。91。214。759 2。91?21S幅S密SI折呆写、滞 E 2。91。214393.5、 2。9 凸92L
