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1、非诺贝特对大鼠主动脉 MMP-9及PPAa表达影响作者：祝庆，康维强，王熙宁 1 青岛市海慈医院心内科，山东 青岛 266033; 2 青岛市市立医院 ; 3 山东省立医院肾内科【关键词】 明胶酶 B摘要目的 观察饱和脂肪酸对大鼠主动脉 MMP-9及PPAa表达的影响及 非诺贝特对其的保护作用。方法 雄性 Wistar 大鼠 30 只，随机分为对照组、高 脂组(HF组)、高脂加非诺贝特组(HF+FF组)。分组喂养20周后，采用RT-PCR 方法测定大鼠主动脉 MMP-9和PPAa 的mRN冰平；采用 Western blot 方法测 定大鼠主动 脉MMP-9和PPAa蛋白表达水平。结果HF组大
2、鼠主动脉MMP-9mRN及其蛋白水平均明显高于对照组(t= 4.65、5.48 , P0.01);PPARa mRNA 及其蛋白水平则低于对照组(t=2.52、2.98 , P0.05)。 HF+FFfi PPARc mRNA 及其蛋白水平明显高于 HF组(t=4.51、6.29 , P0.01)，而MMP-9 mRN及其蛋 白水平则明显 低于HF组(t= 5.62、5.97 , P 0.01)。结论 非诺贝特可上调 PPAa表达，下调MMP-9水平，从而对动脉粥样硬化的发生和发展可能起到保 护作用。 关键词 明胶酶 B; 过氧化酶体激增剂 ; 动脉硬化 ; 非诺贝特INFLUENCE OF
3、FENOFIBRATE ON THE EXPRESSION OF MMP-9 ANaD POPFAR THE RAT AORTAZHU QING， KANG WEI-QIAN，G WANG XI-NING(Department of Cardiology ， Hiser Hospital of Qingdao ， Qingdao 266033， China)ABSTRACT Objective To study the effect of high-fat diet on the expression of MMP-9 and PPAR a in the rat aorta and the p
4、rotective effect of Fenofibrate. Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into control group ， high-fat diet group (HF) and Fenofibrate-treated group (HF + FF). Fenofibrate was administrated orally for 20 weeks ， plasma triglyceride and cho-lesterol levels were measured. Protein levels
5、and mRNA levels of MMP-9 and PPAR a of rat aorta were determined using Western blot and RT-PCR. Results In HF group， both the mRNA and its protein levels of MMP-9 in rat aorta were higher than that in the control group (t= 4.65， 5.48; P 0.05)，while the expression of PPAR a and its protein were lower
6、 (t= 2.52，2.98; P 0.05 ). In HF+FF group ， the expression of PPAR a mRNA and its protein increased compared with HF group (t= 4.51， 6.29; P 0.01) ， while MMP-9 mRNA and its protein decreased (t= 5.62， 5.97;P0.01). Conclusion Fenofibrate may up-regu-late the expression ofPPAFOc and down-regulate that
7、 of MMP-9 , thus to play a role in the protection of the occurrence and develop- ment of atherosclerosis.KEY WORDSgelatinases B; peroxisome proliferators; arteriosclerosis; Fenofibrate在目前冠心病的基础与临床研究中，高脂血症等危险因素与冠状动脉内粥 样斑块形成的相互关系已经得到广泛证实和认同。大量研究结果显示，IL 、hs-CRP MMP-欝炎性因子及Apo基因多态性表达在动脉粥样硬化（AS）过程中起到 了重要的
8、作用，并与高脂血症等危险因素有着某种相关性。基于此，在众多的 血液和组织因子中，寻找一个与动脉粥 样硬化斑块及其危险因素均具有较高敏 感性和特异性的相关因子，成为目前冠心病研究工作中的新热点。本项实验研 究即以此为出发点，探讨在高脂饮食诱发动脉粥样斑块的过程中，非诺贝特对 MMP-9及 PPAR表达的影响，以及 MMP-Sf动脉粥样斑块形成可能的相关性。1 材料与方法1.1 实验动物雄性Wistar大鼠30只，体质量180200 g，由山东省卫生防疫站提供。 大鼠由专人单笼饲养，明 暗周期为 12 h ，自由饮水，房间温度保持在 （25 1） C,湿度在50流右。适应性饲养1周，随机将大鼠分为
9、对照组、高脂 组（HF组）和高脂加非诺贝特组（HF+FF组），每组10只。1.2 药品和试剂大鼠饲料购自山东华康饲料公司。PPAR激活剂非诺贝特购自山东医药公 司。RT-PCR式剂盒购自大连宝生物技术有限公司；组织蛋白裂解液、MMP-9和 PPARa 一抗及相应二抗均购自Santa-Cruz公司；蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad 公司；B -actin 一抗购自Ambion公司。1.3 饲养方法对照组大鼠食用标准饲料 ；HF 组给予高脂饮食，脂肪热量占 59%，以饱和脂 肪酸为主;HF+FF组在HF组基础上加用非诺贝特（20 mg?kg-1?d-1）。各组大鼠 每日膳食热量控制在每只 310
10、kJ ，每天 9:00 定时灌胃，喂养 5 个月。然后抽 血处死大鼠，取主动脉冻存。1.4 RT-PCR采用Trizol法抽提大鼠主动脉总RNA RT- PCR反应依据TaKaRa- RNAPCRki说明进行。PCR反应扩增MMP-9和PPAR所用引物如下。20卩L逆转录体系中加入RNA 1卩g。紫外线分光光度仪（DU640）测定 RNA量和纯度。其中GAPD为内参照。RT-PCR反应体系50卩L,扩增产物经15 g/L 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶影像分析仪 (Al- phaimager 2200) 测定各条带的吸光度值，计算各目 的条带与内参照的比值。1.5 血脂的测定血三酰甘油(T
11、G)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)和总胆固醇(TC)含量分别采用GPO-PA乙酰丙酮法和CHO-PA法测定。1.6 Western blot液氮冻存的主动脉剪碎，加入预冷的 TBS洗涤2次，按1 : 10比例加入预 冷的裂解液，超声仪裂解组织10 s , 4 C静置30 min使其充分裂解;4 C下12 000 r/ min离心10 min，取上清，改良Lowry法测定胞浆蛋白浓度；核蛋白提 取按照Pierce公司试 剂盒说明进行。3X Loading Buffer 稀释各样品蛋白， 60 C下变性30 min，上样10卩g，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、转
12、膜、封闭过 夜后，分别加入PPAa和MMP-9-抗4 C振荡过夜，TBS/T冲洗5 min，共3 次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗常温振荡孵育1 h，TBS/T冲洗5min,共3次，ECL法显影，凝胶影像分析仪测定蛋白条带浓度后，计算各蛋白 条带和内参照的比值。1.7 统计学处理数据用 x+s 表示， SPSS 10.0软件处理数据，组间比较采用 t 检验。2 结果2.1 各组血脂测定结果HF组大鼠血脂各项指标水平较对照组明显升高(t=3.699.32，P 0.05);HF+FF组TC HDL-C LDL-C水平较HF组水平明显降低(t= 2.93 5.24，PvO.05)。表1各组大鼠
13、血脂测定结果(略)3 讨论众所周知，高脂饮食可使血浆胆固醇和三酰甘油水平明显升高，是导致以 动脉壁脂质蓄积为特征的AS改变的主要因素，而斑块纤维帽的稳定，取决于间 质1型胶原这一主要支持分子，而 MMP-9具有溶解它的作用1。而且MMP-9 不仅表达于单核细胞，而且表达于平滑肌细胞和泡沫细胞，表达率和强度尤以 不稳定斑块为著2。此外，MMP-9还有分解1、2、3、4、6型胶原和弹性蛋 白、粘连蛋白和、层蛋白的作用，并通过 MMP-2、 3、 9加重基质的溶解作用， 还能调节细胞因子IL-2、IL-8、TNF-1和T细胞膜蛋白CD2 CD4 CD8从而 加重炎症反应。作为脂质和脂蛋白代谢的调节物
14、，PPAa可以调控血浆胆固醇水平、促进脂肪细胞分化、影响巨噬细胞内胆固醇内稳态、稳定 AS斑块、抑制血小板聚集，从而影响 AS的发生和发展3。另外，PPARai激动剂可抑制 MMP-9的表达，这种PPARe依赖的抑制作用可防止AS斑块的破裂及其导致的血栓形成4 。 PPAR的这两方面作用，可以解释上述高脂药物干预组大鼠MMP-9明显降低的原因。本项实验中，与对照组相比，HF组TC LDL-C水平明显升高，HDL-C则显著下降，验证了高脂饮食可以导致高脂血症作用；同时，高脂组MMP-9表达增强，而PPAa表达相应减弱，提示高脂血症造成MMP-9表达增强，可能是通过对PPAa表达的抑制实现的。在
15、HF组与HF+FF组的比较中， 可以看出，PPAa激活剂可以显著增强PPAa表达水平，而同时MMP-9水平 明显下降，存在以下两方面可能原因：一是PPAa激活剂有效降低了血脂水 平，进而抑制了 MMP-9勺表达；二是PPAa表达增强，直接降低了 AS斑块组 织中MMP-9的表达水平5，6。本实验揭示了高脂饮食与大鼠主动脉MMP-9表达之间的相关性，并证实PPAa激活剂可以有效降低血脂水平并抑制MMP-9 表达，从而起到抑制和稳定动脉内壁粥样斑块的作用。同时也可以看出，高脂 血症状态及MMP-9表达增强，亦可明显抑 制PPAa的水平。两者间明确的相 互作用机制，则有待进一步研究。随着对两者关系认
16、识的不断深入，相信会对 AS的药物干预产生积极的指导意义。参考文献1 P0LLANEN P J, LEHTIMAKI T，MIKKELSSON J et al. Matrix metalloprote in ase 3 and 9 gene promoter polymor- phisms: joi nt acti on of two loci as a risk factor for coronary ar- tery complicated plaquesJ. Atherosclerosis ， 2005，180(1): 73-78.2 ZENG B，PRASAN A FUNG K C, et al. Elevated circula- tinglevels
