荧光定量PCR引物设计

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1、荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌 似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。 个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否 很高适当降低反应退火温度看看是否有效 看所扩增片段 GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常 用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达 看 RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整 设好内参正对 照 最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧 1 设计的时候尽量靠近基因的 3 端这样能最大限度地保证扩增 效率 2 尽量跨越内含子这样

2、可以保证检测有无基因组污染 3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在 80200bp之间最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变 化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设 计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上一般Tm80以 下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组 产物Tm不要高于94个人观点。如果同时检测很多对基因的 表达量变化我会尽量调整所有产物的 Tm 值与内参产物的 Tm 相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。 3 相对错 配来说我认为 dimer 和 harpin 对 realtime PCR 的影响更大当 然也别错配得太邪门了非来一条跟

3、产物出峰在相同位置或 者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。 5一 般我们用 Primer Premier 设计软件我一般先让软件自动搜索 正义链或反义链的引物找到一条评分是 100 的再在它左右合 适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的 引物一般 5 分钟之内可以搞定一个基因。 实时定量 PCR 引 物设计的具体要求 1、引物应用核酸系列保守区设计并具有 特异性。最好位于编码区 5 端的 300-400bp 区域内可以用 DNAMANAlignment 软件看看结果。 2、不能形成 2 级结构 3、引物长度一般在 17-25bp 之间上下游引物不能相差太大。 4、GC

4、含量在 40-60 之间 45-55 最佳。 5、碱基要随机分布 尽量均匀。 6、引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。 7、 引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物567端 可以修饰。9、36令8端不可修饰而且要避开ATGC rich 的区域避开 T/C A/G 连续结构 2-3 个。 10、引物 3 端要避开 密码子的第三位。 11、引物整体设计自由能分布 5 端大于 367端。12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。 实时定量 PCR 完全手册 方法简介 所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信 号的实时检测从而实现对起始模板定

5、量及定性的分析。在实 时荧光定量 PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着 PCR 反应的进行 PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等 比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们 就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条 荧光扩增曲线。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种 类型 1 外参法终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参 照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监 测易出现假阴假阳结果没有监测扩增效率定量不准。 2 内参 法终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反 应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测排除假阴结果 但是定量不准。 3

6、外标法过程监测。这种类型监测扩增效率 阳性样本定量准但是无法排除假阴结果。 4 内参法过程监 测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应用同样的 Taq 酶 和反应参与物存在竞争性抑制起始模板量浓度高的反应会 抑制起始模板量浓度低的反应所以定量不准。 5 外标法过程 监测内对照。这种类型监测扩增效率阳性样本定量准同时排 除假阴结果。这种类型是应该提倡的。 在国家没有出台阴 阳判定标准时所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝一个 病毒。从理论上说只要有一个拷贝数样本就算阳性一个拷贝 数都没有才算阴性。 所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过 对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从 而

7、实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着 PCR 反应的进行 PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。每经过一个 循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度 变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线。 PCR 过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式 1R Green I 检测模式。温度循环为 945572C 三步法只有引 物无探针荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向 的强荧光检测获得信号这种试剂检测模式易产生非特异信 号且本底光较大。 2 解探针模式 TaqmanHydrolysis Probe 。 温度循

8、环为9460C二步法不仅有引物还有另外一个特异 针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上 分别结合两个荧光染料一个染料接受激发光得到的能量传 给了第二个染料接受能量的第二个染料通过发射特征光子 回到稳定态。当Taq酶在60C延伸扩增链时遇到探针利用 Taq酶53外切酶活性将探针水解成单个碱基单个碱基之间 距离较远第一个染料的能量无法传给第二个染料只好通过 发射特征光子回到稳定态通过对溶液中第一个染料的荧光 检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性 但是由于利用了 Taq酶53外切酶活性一般试剂厂家只给 Taq酶的聚合酶活性定标没有同时给Taq酶53外切酶活性 定标不同批

9、号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔 点温度Tm仅要求其高于60C这就使不同试剂盒之间的特异 性参差不齐而且无法做质控检测。 3 杂交探针 Hybridization Probes模式。温度循环为945572C三步法有引物二个 特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间在一个探针3碱 基上结合一个荧光染料在另一个探针5碱基上结合第二个荧 光染料。在55C时两个探针都刚好接合在模板上第一个染 料接受激发光得到的能量传给了第二个染料接受能量的第 二个染料通过发射特征光子回到稳定态通过对结合在扩增 模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂 检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关探针的浓度

10、始终 保持不变因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异 性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。RT-qPCR是由三个步骤组成：1.反转录:依赖反转录酶将RNA 反转录成cDNDA 2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA 3.检测： 实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键 点 Key porint: 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理 的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定 性 3.数据分析应该高度客观如果不合理的分析从分析结果 中会得到混淆的错误结果因此通过对RT-qPCR的每一组分 进行质量评价以达到最小化变异性最大化可重复性而且还 需要

11、沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标 准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。 存在的问题 由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程必然导 致大家使用不同定量的来源物以及数据分析 1.新鲜、冰冻、 甲醛固定的样品 2.整个组织样本显微切割样本单个细胞组 培细胞3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不 同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合 6.变异系数、 灵敏度 7.多类型的检测化学方法反应的条件热循环仪的分 析以及汇报方式。 8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在 样品的处理内参的使用归一化的方法质量控制等等因素严 重影响RT-qPCR的可信度重复性。RN

12、A质量评价现在 RNA 定量的程序很多。最近 EMBO qPCR course http:/www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28 比较了用 Ribogreen Agilent BioAnalyser spectrophotometerNanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有 哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定 量是不明智的。因此我们需要用统一套定量分析方法来完成 所有RNA样品的评价。RNA质量RNA质量主要包括 RNA 的纯度没有蛋白质和 DNA 的污染以及完整性。传统的 R

13、NA 质量的评价通过分析 A260/A280 的比值或者对琼脂糖 凝胶电泳 rRNA 的条带的分析。 Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法它通 过分析18S以及28S rRNA的分析图谱通过图谱来反应RNA 的量和完整性其完整性通过完整性系数 RIN 来反应。样品的 RINs 在 10-4 之间。 10 代表完整的 RNA4 代表没有完整的 rRNA 带。 由于以上的方法并非 100 准确定反应 mRNA 的 完整性因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mR

14、NA的完 整性。这里推荐一种方法采用GAPDH的36856令8分 析法。我们使用oligo dT进行逆转录然后对逆转录的cDNA 用 multiplex 荧光定量评价。设计三个 taqman 探针来定量三 种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于36令8568以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA 的完整性。如果368568的比值在1反应较高度完整 性如果高于5说明降解。 QRT-PCR 抑制物的组成 QRT-PCR抑制物严重减少了 PCR的灵敏度以及热动力学反 应高度的抑制还导致假阴性的结果。 抑制物的来源生物样 品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物盐离子尿素血红素 heparin以及Ig

15、G.是否有抑制物的评价体系1.通过对目的样 品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测2.通过内部扩增 对照来反应样品处理过程中样本的情况 3.用细菌检测临床 样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反 应目标检测物的抑制情况 反转录反应系统1.RT和PCR单 一酶系统2.RT和PCR分离的酶系统3.RNA逆转录引物的 选择引物主要有三种1.随机引物随机引物特别是6nt引物 对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果建议使用 15nt 的随机引物.2.oligo-dT只能用于mRNA完整的样品特别有 polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的368UTR 的区域比较困难 3.特异引

16、物最特异最灵敏的方法。特别 RNA量足够情况下建议使用此法。PCR优化PCR优化主 要有1.引物的浓度2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试 笔者建议的操作流程: 一靶的 选择和试验设计 1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断 查看以下三个网站是否有合适的已经证实的 QRT-PCR 的扩 增引物探针以及反应条件. RTPrimerDB http:/medgen.ugent.be/rtprimerdb 相对物种较多 PrimerBank http:/pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html 人鼠 Real Time PCR Primer Sets http:/www.realtimeprimers.org 人 mouserat 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考以 下的设计方案仅供参考:A.最广泛使用的商业化的软件 Beacon Designerhttp:/ B.DIY 的