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1、免疫荧光实验步骤1. 直接免疫荧光法测抗原（1）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异 性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制 备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤 活检的免疫病理检查。（2）试剂与仪器? ? ?磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 0.01mol/L，pH7.4? ?荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释？? ?缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2? 0.2M碳酸盐缓冲液1份 配制? ?搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 P
2、BS 1500ml）? ?有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）？? ?荧光显微镜？? ?玻片架？? ?滤纸？? ? ? 37C 温箱等。（3）实验步骤 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持 一定湿度。 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒 内，保温一定时间（参考：30min）。 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油， 以盖玻片覆
3、盖。 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“ + ”表示： （-）无荧光；（土）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+ ）荧 光明亮；（+ -+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达+ ”以上， 而各种对照显示为（土）或（-），即可判定为阳性。（4）注意事项1）对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度 不应超过1： 20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25C左右），高 于37C可加
4、强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用 0-2C的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37C30 min效果好的多。3）为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非 特异性荧光染色的干扰。 标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L, pH7.4的PBS。 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特 异性抗体。 阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈 强荧光，则为特异性阳性染色。4）一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染
5、色 的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。2. 间接免疫荧光法测抗体（1）基本原理染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标 本上，在湿盒中37C保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合 的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一 步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结 合，从而可鉴定未知抗体。（2）试剂与仪器? ? ?磷酸盐缓冲盐水（PBS）： 0.01mol/L，pH7.4? ?缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配 制。? ?
6、荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。? ?搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml） ? ?有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）？? ?荧光显微镜？? ?玻片架？? ?滤纸？? ? 37C温箱等。？（3）实验步骤1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片 保持一定湿度。2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标 本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37C保温30min。3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的P
7、BS冲洗1-2次，然后 按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度 的荧光标记的抗人球蛋白抗体。5）将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37C保温30min。6）重复操作3。7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8）荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。（4）注意事项1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4C保存4h，时间过长，会使荧 光减弱。2）每次试验时，需设置以下三种对照： 阳性对照：阳性血清+荧光标记物 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上， 避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
