反硝化细菌项目说明书

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1、筛选好氧反硝化细菌处理工业废水设计说明书设计者吕海鹏鹿宗贵韩飞怡 指导老师柯涛 （南阳师范学院生命科学与技术学院河南南阳 473061） 摘要通过定向富集，从污水处理池活性污泥中筛选出具有高效降解亚硝态氮能 力的好氧反硝化细菌，并在实验室条件下，对该菌株在天然水体中的反硝化活性进 行系统的研究，制作出可用于生物脱氮的微生态菌剂。该菌剂具有成本低、易操作、 达标排放可靠性强且无二次污染等优点。关键词污水处理厂好氧反硝化细菌微生态制剂生物脱氮作品内容简介本研究是以污水处理池中活性污泥为原料，筛选出具有高效降解亚硝态氮能力的好 氧反硝化细菌，生物脱氮以其无污染、脱氮彻底等优点被认为是目前最经济、有效

2、、 可行性高的水体除氮方法。但由于种种原因 ,目前国内外市场尚无可有效治理水体 亚硝态氮污染的微生态制剂产品。本研究分离得到的反硝化菌菌株具有良好的脱氮 效果。应用于废水脱氮，能适应各种不良的环境条件，具有开发成微生态制剂应用 于受污染水体脱氮的巨大潜力。市场潜力大，应用前景广阔，具有显着的社会、经济效 益，具有很高的推广应用价值。本研究采用定向富集（反复筛选）的方法，从污水处理池活性污泥中筛选出具有高效降解亚硝态氮能力的好氧反硝化细菌。该方法操作简便、可行，反复筛选具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点。具有较好的科学性和先进 行。不仅降低了工业废水对水体环境的危害，还可制得

3、环保、高效去除水体富营养化的微 生物菌剂，由此带来的环境效益和社会经济效益是非常显着的。按本方法筛选到的好氧反硝化细菌市场潜力大，推广应用前景广阔，具有显着的经济效益我国每年用于环境污染投资约为830亿元，约占当年GDP的1%。尽管如此，水环境污染趋势仍然没有得到有效控制，每年由于水质污染引起的损失共约为500亿元。同时，项目实施后可安排社会闲散人员就业，减轻就业压力，产生较好的社会效益。利用活性污泥筛选出TIN去除率较高的好氧反硝化细菌，不仅能减少工业废水对环境的污染，而 且能充分利用资源，变废为宝，具有显着的环境效益。联系人：吕海鹏1 研究背景及意义2 20 世纪 60 年代以来，世界上水

4、体污染达到极为严重的程度，震惊世界的几起公害事件 相继发生，引起了科学界和政界的重视，保护环境，治理污染成了人们普遍关注的问 题，而工业废水的不合理排放更是关注的焦点。我国每天排放大量的工业的废水，对 江河湖海造成严重的污染。据统计，全国27 条主要河流，大多数被严重污染，工业废 水的不合理排放不仅增加水处理的难度和用水成本，还引发严重的生态问题，导致江 河湖海含有过量的氮、磷营养物质，使藻类和其他水生生物大量繁殖，造成水质恶化， 形成水体“富营养”和“水华”现象。同时我国是世界水产生产大国，水产品总量十 几年来一直位居世界第一。据统计，2004 年我国水产养殖总产量达到 3209 万吨，占世

5、 界水产养殖产量的三分之二以上。但目前主要采用的集约化高密度养殖，如施肥给饵 和密集轮养等养殖方式，会在养殖水体中积累大量的鱼类粪便、食物残渣和死亡的动 植物尸体，导致水体氮素含量严重超标，富营养化情况严重，鱼虾病害频频发生，给 水产养殖业尤其是高档精养池塘造成巨大损失。作为水体氮素存在形式之一的亚硝酸 盐的控制一直是水产科学工作者研究的热点。这是因为它是水产动物致病的根源之一， 其危害主要表现在它可以将鱼虾体内的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，使其丧失 运输氧的能力，从而造成鱼虾的窒息死亡。我国淡水渔业用水标准规定,养殖水质中的 亚硝酸盐氮应控制在 0.2ppm 以下，河蟹、对虾育苗水质的亚

6、硝酸盐氮应控制在 0.1ppm 以下。本项目研究的生物修复技术是一种治污新模式，通过定向富集，从污水处理池活性 污泥中筛选出 TIN 去除率较高的好氧反硝化细菌，并在实验室条件下，对该菌株在天 然水体中的反硝化活性进行系统的研究，制作出可用于生物脱氮的微生态菌剂在废水 处理方面,同步硝化反硝化相对于传统的生物脱氮工艺具有明显的优势。通过微生态制 剂的直接投放，以及鱼类和水生植物的协同作用达到净水的目的。它具有高效、无二 次污染，成本低、投资省，使用简单易操作等特点。本着消除污染，筛选高效去除水 体富营养化的微生物菌剂，进而促进经济的可持续发展。利用活性污泥筛选出TIN去 除率较高的好氧反硝化细

7、菌，不仅能减少工业废水对环境的污染，而且能充分利用资 源，变废为宝，具有显着的环境效益。2 作品研究内容2.1 研制目的本着充分利用资源、消除污染，制取可高效去除水体富营养化的微生物制剂，促进经 济的可持续发展为目的。而从活性污泥中筛选好氧反硝化细菌。2.2 实验材料和方法主要仪器:超净工作台（SWCJ-A）,高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱（SPX-160型），摇床 （HNY-200D），电子天平等。主要原料及试剂：BTB培养基（琼脂20g、KN031g、KH2P041g、FeCl2 6H2OO.5g、CaCl27H200.2g、MgSO47H201g、琥珀酸钠8.5g、溴百里酚蓝（BTB）（1%

8、乙醇溶液）lmL, 用lmol/L的NaOH调节pH至7. 07.3, 121C灭菌20min）, LB培养基（KNO31g、KH2P041g、 FeCl2 6H200.05g、CaCl2 7H200.02g、MgS04 7H201g、琥珀酸钠8.5g, 121C灭菌20min）。 格里斯试剂A、B液，二苯胺试剂，其他试剂均分析纯。2.2.2 取样南阳市污水处理厂曝气池中活性污泥； 南阳师院十二里河污泥；南阳师院阳子湖湖水；南阳师院周围麦田土样。2.2.3 实验方法采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取O.lmL均匀涂布于BTB培养基表面，置 入恒温培养箱，30C下培养23d后，用接种环挑

9、取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落， 进行分离纯化即为初筛菌株。将初筛筛选出的好氧菌株接种到LB液体培养基的试管中，每支试管分装培养基的高度 约为45cm，每株重复3管，在30C恒温下培养7d以上，每天观察其生长情况，检查试 管是否混浊。并用格里斯（Griess）试剂检查培养液中是否已出现亚硝酸根。如果呈桃红 或红色反应，说明硝酸盐已经在反硝化菌作用下生成亚硝酸盐，即为正反应。如为负反应， 则就要检查培养液中是否还有硝酸根，即置白瓷板凹窝中加浓硫酸和二苯胺试液各 2 滴， 然后滴入待测液12滴，如果有蓝色出现，说明有硝酸根存在，即未进行反硝化作用，受 检查管无反硝化细菌存在，如不出现蓝色，则说

10、明硝酸根已完全消失，且作为硝化作用中 间产物的亚硝酸根也完全消失，这证明受检查管的反硝化作用很强烈，有反硝化细菌存在， 检查时应与空白对照，将检出具有反硝化作用的好氧菌作为复筛菌91，并将其接种于 3 号培养基的试管斜面，作为备用菌。2.3 分析方法该方法是利用在培养液中滴加格里斯试剂、二苯胺试剂和奈氏试剂，通过显色反应指示亚 硝态氮、硝态氮和氨态氮的变化31，从而筛选出对硝态氮有较强利用效果的菌株。在培 养液中加入12滴格里斯试剂，以检测是否有亚硝酸盐的存在，如溶液立即呈粉红色或棕 色等，则硝酸盐被还原成亚硝酸盐，说明该溶液中具有好氧反硝化作用的细菌。如无红色出 现，再加入二苯胺试剂，若培养

11、液呈蓝色，则表示该培养液中硝酸盐未被转化，溶液中无反 硝化细菌;若无色，则表示硝酸盐和刚生成的亚硝酸盐都已原 成氮氧化物，说明该溶液中具有较强好氧反硝化功能的细菌。2.3 菌株的分离与鉴定从十二里河的污泥中筛选到 20 株生长比较旺盛，反硝化能力较强的好氧反硝化细菌，分别接入含有硝酸钾的LB培养基中培养2-3d通过格里斯试剂检测菌株的反 硝化速度，先有无色粉红色玫瑰红色棕色无色（滴入二苯胺仍为 无色）先完成这个过程的细菌反消化能力较强，每隔 12个小时检测一次，从中筛选 8株菌做鉴定。菌株编号格里斯试剂检测结果12h后24h后36h后48h后1粉红色玫瑰红色棕色无色2无色粉红色玫瑰红色棕色3粉

12、红色玫瑰红色棕色无色4无色无色粉红色玫瑰红色5无色无色粉红色玫瑰红色6粉红色玫瑰红色棕色无色7无色粉红色玫瑰红色棕色8无色粉红色玫瑰红色棕色9粉红色玫瑰红色棕色无色10无色粉红色玫瑰红色棕色11粉红色玫瑰红色棕色无色12无色无色粉红色玫瑰红色13粉红色玫瑰红色棕色无色14无色粉红色玫瑰红色棕色15粉红色玫瑰红色棕色无色16无色粉红色玫瑰红色棕色17粉红色玫瑰红色棕色无色18无色粉红色玫瑰红色棕色19无色无色粉红色玫瑰红色20无色无色无色粉红色通过上表分析得 1、3、6、9、11、13、15、17 号菌株为反硝化能力强的优势 菌株。将 8 株菌接种后第 2 天即产生大量气泡,迅速降解亚硝态氮和总

13、氮的菌株。6 号菌株 通过革兰氏染色法在显微镜下观察鉴定该菌株为革兰式阳性菌株，同时进行显微拍 照观察该菌的外形为球形。2.4 菌株反硝化特性静置培养条件下，菌株在接种后的 3h 进入了对数生长期，在 10h 菌体浓度达 到最高，随后进入生长稳定期，在23h左右进入衰亡期。在对数生长期，由于培养 基中含有丰富的营养物质，此时用于菌体增殖的氮源主要是培养基中的有机氮，而 在生长稳定末期及衰亡期，菌体基本不再增殖，此时培养基中的亚硝态氮浓度的变 化应该是由于反硝化作用引起的。反硝化碳源通常分为三种类型 :第一类是易于生物降解的有机物 ,如实验中采 用的甲醇、乙醇、蔗糖、葡萄糖等;第二类为可慢速生物

14、降解的有机物,如实验中的 可溶性淀粉等;第三类为细胞物质,细菌会利用细胞成分进行内源反硝化。碳源的种 类对菌株的反硝化活性有很大影响。一般来说，在反硝化过程中，易于生物降解的 有机物是最好的电子供体，不仅反硝化速率快，还能够提高生物处理装置的能力和 效率，使反硝化过程稳定可靠102.5 反硝化碳源试验以 LB 培养基（KN031g、KH2P041g、FeCl2 H200.05g、CaCl2 7H200.02g、MgS04 7H2Olg、 蒸馏水1000ml、PH7.07.3为基础培养基，分别加入不同碳源柠檬酸钠10g、乙醇10g、 醋酸钠10g、葡萄糖10g、可溶性淀粉10g、甲醇10g作为唯

15、一碳源配制培养基。按1%接 种量接入活化并用无菌水洗涤干净的菌液，30C静置培养60h后检测培养基中亚硝 态氮的降解率。2.5.1BTB 平板筛选法该方法适用于对培养条件有特殊营养要求的某种好氧反硝化菌的定向筛选。运 用此方法在好氧条件下，利用平板的抑菌圈大小，筛选到对不同碳源适应能力不同 的 20 株好氧反硝化细菌菌株。2.6 菌株在天然养殖水体中的反硝化特性 取回的阳子湖水样经处理后,分为两部分，一份加入硝酸钾（氮源）和葡萄糖（碳 源），分别取 50ml 分装于四个锥形瓶中，一组只加入硝酸钾，取 50ml 装入一个锥形瓶中，121C,30min灭菌处理后，将不同浓度的菌种（lml）接入锥形瓶中，28C 恒温培养。用格里斯试剂定时检测颜色变化。加N、C只加N无C加N、C加N、C加N、C投菌浓度（个检测时间不投菌3X1073X1073X1083X10912h无色无色无色粉红色玫瑰红色16h无色无色无