绿色荧光蛋白基因的克隆和表达

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1、绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP )是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠 动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底 物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长2。 6kb;GFP 是由 238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27。OkMr,其蛋白性质十分稳定，能耐受60C 处理.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光

2、基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶 的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则 位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6567位的SerTyrGly自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm,宽240 nm, 由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶 部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位 于大空腔内。实验一 质粒 DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。该法用于

3、从小量培养物中抽提质粒DNA, 比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今 为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子,分子量范围从1kb到200kb.质粒DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随 着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶 体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制， 因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质

4、粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严, 称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200 个拷贝.当宿主细胞的蛋白质合成受到抑 制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至 每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千.质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化 进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药 基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型.借助转化菌获得的新表型 特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记.质粒作为基因克隆载

5、体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有 许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤细菌的生长和质粒的扩增;菌体 的收集裂解，质粒DNA的分离;质粒DNA的纯化.1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛 型质粒（如pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就 可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于严谨型质粒（如pBR322）来说， 则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩 增。2、菌体的收集、裂解和质

6、粒DNA的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主 要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒 DNA 大得多.（2）从细胞中提取得到的 大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子,而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。这里主要介 绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS （十二烷基硫酸钠）和NaOH使菌体裂解（有 时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变 性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸 性的NaAc或Kac中和碱性NaOH），质粒DNA链迅速

7、得到准确配对，重新恢复成天然的超螺 旋分子通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋 分子仍滞留于上清中。3、质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余 蛋白质及RNA,达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型:共价闭合环形DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型） 和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不 同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是 SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。

8、三、实验材料、仪器及试剂1. 在含有pEGFPN3质粒的DH5a平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中。摇晃过夜.在含有 pET28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜.2、使用仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器,冰箱四、实验步骤1. 取1。5ml DH5a培养液倒入 1。5mL eppendorf管中，13000rpm离心 1 min。2. 重复1。3. 弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽.4. 菌体沉淀重悬浮于lOOyL溶液I中（需剧烈振荡），室温下放置10min。5. 加入新配制的溶液112001,盖紧管口

9、，快速温和颠倒eppendorf管5次，以混匀内容物（千 万不要振荡），冰浴5min。6. 加入150yL预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次，使沉淀混匀，冰浴中15 分钟,13000rpm 离心 5min。7. 上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）,振荡混匀，13000rpm离心 2min。8. 将水相移入干净eppendorf管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24： 1）振荡混匀，13000rpm 离心2min.9. 将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后，置于室温下2min， 然后 13000rpm

10、离心 5min。10. 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70%乙醇洗沉淀一次，振 荡混匀后，13000rpm离心5min。11. 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。12. 将沉淀溶于30yL TE缓冲液（pH8。0,含20yg/mL RNaseA）中，保存在一20C冰箱中。13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在一20C冰箱中.五、实验结果实验二 质粒DNA浓度的测定一、实验目的 学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。二、基本原理核酸分子在 260nm 下有最大吸光值，因此可以通过 260nm 下核酸的吸光值计算核酸

11、浓度 （mg/ml），并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度.三、实验材料与仪器1、实验材料pEGFPN3 和pET28a DNA2. 使用仪器Eppendorf核酸蛋白测定仪,移液枪四、实验步骤1. 按下Eppendorf核酸蛋白测定仪IdsDNA,比色皿中加入100 ul ddH2O,庖云目空白对照。2. 取一 0。5ml离心管，吸取质粒DNA 5ul，然后再加入95 ul ddH2O，混匀。3. 将100 ul的溶液转移到比色皿中,注意不要出现气泡。4. 按下Sample ,记录260nm 下 DNA 的浓度（mg/ml）.并同时记录 OD260nm/280nm, O

12、D260nm/230nm的比值，估测DNA的纯度。5. 计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度X20 （mg/ml）,DNA的纯度：OD260nm/280nm=l。80.1 （如果低于1。7,说明样品中蛋白质去除的不完 全，或样品中有苯酚的污染；如果高于1。9,说明样品中RNA去除的不完全。）0D260nm/230nm2。0实验三琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化DNA片段的比较方便、省时的技术:琼脂糖凝胶 电泳的基本原理和操作方法.二、基本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有:（l）DNA分子的大小 双链DNA分子在凝 胶基质中迁移的速率与其

13、碱基对数的常用对数成反比。分子越大,迁移的越慢,因为摩擦阻力越 大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存 在线性相关。（3） DNA的构象 超螺旋环状（I型）、切口环状（II型）和线状（III型）DNA在琼 脂糖凝胶中以不同速率迁移.其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型,其次是电流 强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，1型DNA比III型迁移得快； 在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所

14、用的电压成 正比.电场强度升高时,高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以,当电压增大时琼脂糖 凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5 8V/cm。（5）电泳缓冲液DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导 率降低，DNA或者不动或者迁移很慢高离子强度时（如10Xbuffer），电导率升高，使得应用 适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。三、实验材料、仪器及试剂1、实验材料质粒 DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器,冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1、1琼脂糖凝胶的配制(1)加20ml 1XT

15、BE缓冲液于三角瓶中，(2) 精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化(3)冷却至60C左右，(4)轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上,(5) 将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液(TBE)中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm, 轻轻拔除梳子，(6) 取5ul质粒DNA及2ul GeneFinder混匀上样(7) 50-100v约电泳0。51小时( 8)蓝盾可见光透射仪观察结果。五、实验结果实验四 酶切及连接1. 实验目的学习使用限制型内切酶进行DNA酶切的原理和方法。2。实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、 识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆 的一类。II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中 进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合 到DNA 上，因而识别的是对称序列;但有极少的酶作为单聚体结合到DNA 上，识别非对称序列。 一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC;Hind III识别AAGCTT;BamHI识别G ； G