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1、活体动物光学成像系统在活体荧光成像中的应用 第一部分技术原理一、技术简介 随着活体动物光学成像技术在国内外的普及和应用，越来越多的科研人员希望能通过该技术 来观察活体动物体内肿瘤细胞的生长以及对药物治疗的反应，希望能观察到荧光标记的多 肽、抗体、小分子药物在体内的分布和代谢情况Nigh tOWL IILB 983 NC320舌体动物光学 成像系统正是为满足这样的应用需求而设计的。该系统通过荧光光路的特殊设计，实现了对 激发光的能量控制和调节，提高了舌体荧光成像的稳定性和灵敏度，并且该系统操作简单、 费用低廉、不涉及放射性，是不错的进行舌体荧光成像的仪器。与传统技术相比，舌体荧光 成像技术不需要
2、杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的 可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片， 了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是 在药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。Nigh tOWL IILB 983 NC320活体荧光体内成像技术的基本原理是激发光源通过特殊的光路设 计使其能量稳定、强度合适的激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长 的散射光，该散射光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器cooling slow scaning CCD以 光子数量化检测到光强度，
3、同时反应出标记物的数量。二、标记原理 活体荧光成像技术有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白 适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP (DsRed)等。荧光染 料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小 分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳 定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可 调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微 晶体，尺寸在 100nm 以下，外观恰似
4、一极小的点状物。它可以经受反复多次激发，而不像有 机荧光染料那样容易发生荧光淬灭。已经证实了量子点的成像深度远远超过标准的荧光素如 果能与抗体结合配对，就可以作为跟踪组织细胞的探针，或者探测低浓度的抗体。如果能解 决不同材料的量子点偶联、功能化标记问题，就可以用量子点代替很多荧光染料分子。三、技术特性 在活体动物光学成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：1. 荧光染料、蛋白标记能力强 荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生 物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标 记，同时成像。检测的
5、波长范围从300nm到llOOnm，我们可以提供全光谱的滤光片实现几 乎所有荧光标记的体内成像。2. 信号强度大 由于荧光是在外界光源激发下产生的能量转移现象，其光子强度较其它光学信号更强，持续 时间长，信号所反应的样本信息量更丰富，对信号接收仪器的要求相对较低，节省更多的实 验成本。3. 实验成本低 相对于活体生物发光成像来说，费用低廉，不需要底物。荧光发光基团只要在其合适强度的 激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反映不需要添加任何昂贵的反应成分， 只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。4. 活体、尸体、器官全部可以进行成像 由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验
6、样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、 尸解组织器官样本的光学成像。5. 操作简便，测量快速，每次检测时间仅为毫秒级，同时可检测多个动物6.分辨率提高，可达到2-3mm (生物发光的分辨率在3-5mm)但是，任何技术都是优点和缺点并存，荧光成像技术常出现的问题主要有：1. 自发荧光 实验样本尤其是小动物会产生自发荧光，主要是来源于皮毛和血液的自发荧光。对于皮毛中 的黑色素是皮毛中主要的自发荧光源，其发光光线波长峰值在500-520nm左右，在一般的 绿色荧光作为探针时，影响最为严重。另外，食物中的叶绿素、动物血液都会产生较强的非 特异性自发荧光。但生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会
7、发出荧光，产生的非特异 性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光 源，也就会产生很强的背景噪音。2. 光被动物组织吸收特性 在小动物实验时，光在动物组织内传播时会被吸收，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的 特性并不一样，血红蛋白(hemoglobin)，黑色素是造成体内可见光被吸收的主要因素，其 吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光、近红外波段，血红 蛋白的吸收作用却很小，在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。由此可 见，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性要好得多，因此逐渐成为活体荧光成像实验的热 点，活体荧光实
8、验建议选择发射较长波长的标记物，近红外荧光已经成为活体成像标记的重 要选择。3. 背景光干扰在一般epi顶部荧光激发/检测类装置中，激发背景光的干扰也是荧光检测手段的一个问题，目前很多技术类革新都在试图降低背景光的干扰，比如利用侧面激发/顶部接收装置、底部 透射激发装置等改变常规成像仪器的光路设计，达到降低背景光的目的。现有技术采用不同 的原理，尽量降低背景信号，获取机体中荧光的准确信息。目前以NightOWL IILB 983 NC320 为活体动物可见光成像系统为荧光成像的主要代表。第二部分仪器原理以Berthold公司的NightOWL IILB 983 NC320活体动物光学成像系统所
9、示，体内可见光成像系统主要由四部分组成：一、CCD选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。更为合适的CCD是制冷型的前照 射CCD。选用的CCD镜头对于波长600nm左右的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而 且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小Nigh tO WLIILB 983 NC 320活体光学成像系统提供更为合适于荧光检测的CCD是制冷型的前照射CCD，NC 320。NightOWL IILB 983 NC320活体动物可见光成像系统采用的CCD像素大小达到6.8如，像素 达到400万，分辨率可达到5如。综上所述，荧光成像对CCD相机选择的要求是
10、：CCD类型：单光子计数冷CCD，光子计数类CCD可以进行荧光量化分析。CCD像素分辨率：由于荧光背景光较强，产生非特异性杂光干扰明显，需要配有高分辨 率CCD的相机。CCD光谱覆盖能力：全波长覆盖。荧光对其它常见参数的要求：CCD量子效率（QE）:荧光反应光子能量强，CCD容易捕捉到光子信号，CCD不需要 对QE有过高的要求。CCD感光类别（前部感光/背部感光）：背部感光CCD芯片只有在检测极弱光信号优势明显，但在强光检测中与前部感光CCD芯片无差别，但其成本较高的弱势使其不属于荧光检测常规要素。CCD读数噪音：在强光检测中，CCD的噪音影响比起荧光背景光的影响微乎其微，只 有在发光检测时才
11、会显出明显优势。CCD暗电流：荧光检测不需要对CCD暗电流有太多要求。二、成像暗箱 成像暗箱采用德国工艺、精钢锻造，内附高级光学避光涂层，可屏蔽宇宙射线及一切光源， 可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境 的非特异光污染。CCD镜头位于暗箱的顶部，光线通过光圈被CCD收集。暗箱里的CCD相机 是由软件控制升降，升降精度可以达到0.01mm，相机高度与信号收集经过线性校对，通过 升降可以获得宽视野拍照能力，拍照视野（F0V）从3.5厘米到26厘米，最多可同时检测五 只小鼠，并且带有加热装置，可以保持观察实验动物的体温。三、荧光激发和接收系统在活体荧光检
12、测中经常碰到的问题是荧光反射光造成的背景很强，影响信号的检测。因此在 活体荧光检测中对于激发光能量的控制就显得非常重要，当检测样本小，或检测区域小，适 于用低能量的激发光，当样本个体较大，或检测位置较深，则高能量的激发光更适合，或同 时配合gooseneck鹅颈管激发装置使用，效果更佳。同时，一般的荧光光源的能量会随着时 间和波长的变化而变化，这对定量研究的体内实验是极其不利的。在这样的应用需求下， NightOWL IILB 983 NC 320活体动物可见光成像系统率先采用了荧光光源能量反馈控制系 统，并且通过该系统调节激发光的能量在检测时间内的稳定控制，对于每一次荧光检测都可 保证持续稳
13、定的激发光，整个激发光路能量始终统一、稳定，激发光能量直接关系到发射光 信号强弱，需要确保在整个长时间多次成像中输出稳定的激发光，达到检测时间内的稳定控 制，特别是在多编组样本分析时。仪器本身可以通过此系统控制激发光的能量，0%100%可 调节，针对不同的样本使用不同强度的激发光，这就大大提高了活体荧光成像的灵敏度和稳 定性，增加了活体荧光成像技术的应用范围，使仪器成为开放性的检测平台。 在荧光单元，配备典型的荧光激发/接收装置，从顶部激发样本发光，当相机对样本进行调 焦定位时，会同时检测到发射光信号，接收信号强度直接与相机的调焦高度相关，方便获取 最佳观测值。整个装置需要配合选择合适的光源和
14、滤光片来激发荧光团，检测样本的发射光。NightOWL IILB 983 NC320还配有光能在线反馈控制装置，使整个激发光路能量始终统一、 稳定，对于每一次荧光检测都可保证持续稳定的激发光。仪器对于在不同时间发出的同一波 长的光线，或者不同波长的光线，光能稳定对于定量研究非常重要，激发光能量直接关系到 发射光信号强弱，特别是在多编组样本分析时，需要确保在整个长时间多次成像中输出稳定 的激发光。而光源本身能量不是恒定不变的，为此我们的光路配有能量在线反馈控制装置， 实时监控光路，反馈补偿光源能量变动导致的激发能量突增或缺失，以确保整个激发单元的 能量始终统一。光源的光效稳定性有利于定量观察。为
15、了荧光光源发出的激发光能稳定均匀地照射在待测样本上，同时为了检测微小样本或者进 行深度检测，NightOWL IILB 983 NC320活体动物可见光成像系统设计了一系列激发光组件 实现上述目的。环状照射装置，激发高度可调，其特点是输出光线均匀统一，使照射在样品 上的激发能量始终保持统一。鹅颈管照射装置，可以得到spot聚光，针对老鼠等试验动物 局部（头部、四肢、某一内脏部等）或小体型物种（蚕、果蝇等）。鱼尾型照射装置的特点 是聚光激发，高能量激发光可以提高穿透样本皮层深度，增强发射光的强度，适合激发弱信 号（由于浓度低或皮下深度原因）。上述激发装置采用多模块即插即用式设计，使应用更具 针对
16、性及广泛性，操作简便。另外操作软件可以直接控制激发光源的照射能量，它有利于成像系统根据每一种荧光物质、 或实验样本种类及其部位作针对性的调节，在同一样本中对不同荧光团的数量比较就会很容 易实现。软件控制的滤光片支架提供在一个测读次序中激发光和发射光滤光片的快速转换， 特别对比率制检测读数的应用是非常重要的。操作软件中灵活的检测方案设定功能可完成在 同一时间内对不同波长发射光的检测，发射光滤光片之间的转换时间小于500ms，远快于相 机的测读时间。高光阻宽透射率滤光片被安装在仪器最佳的位置，如果客户需要，可以很方 便的更换其它种类的滤光片，Berthold提供全波长滤光片组，多达几百中滤光片可供选择。通常，我们选择经常使用的6种荧光检测配置对应的滤光片，如下所示：GFP: Ex475/20 (53183) Em520/10 (39805)dsRed/RFP:Ex530/20 (38536
