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1、分子生物学复习重点名词解释l.RNAi：由一类小分子RNA介导基因沉默的机制称为RNA干扰（RNAi）2 .信号转导：细胞通讯启动细胞内一系列化学反应，导致一组成分的活性、水平或亚细胞定位改变，最终引起细胞反应，包括改变代谢物浓度和代谢速度，最终导致细胞的生长、分裂、分化、衰老、死亡速度改变，这一过程称为信号转导。3 .基因组：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和即为基因组4 .启动子：是指基因序列中能被RNA聚合酶识别、结合、，从而形成转录起始复合物并启动转录的DNA序列，大多数位于基因（或操纵子）转录区的上游，具有方向性，属于调控元件。5 .基因诊断：基因诊断属于分子诊断，是指直接
2、检测基因组中致病基因或疾病相关基因的结构异常或表达水平的改变，或病原体基因的存在，从而对人体健康做出评价，或对人体疾病做出诊断o6 .逆转录:逆转录又称反转录,是以RNA为模板,以dNTP为原料，在逆转录酶的催化下合成DNA的过程。这是一个从RNA向DNA传递遗传信息的过程，与从DNA向RNA传递遗传信息的转录过程相反，所以称为反转录。7 .cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的CDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。8 .密码子：信使RNA链上（或dna）决定一个氨基酸的相邻的三个碱基，亦称三联体密码。9 .蛋白质组学：应用组学技术研究一定条件下的蛋白质
3、组，包括组成、结构、性质、功能、分布、相互作用和条件变异等，建立和应用蛋白信息数据库。10 .基因治疗：是指在基因水平上治疗疾病，包括基因添加、基因置换、基因修饰、基因干预、自杀基因治疗、免疫基因治疗等。简答题1.基因治疗方法和步骤基因治疗是指在基因水平上治疗疾病，包括基因添加、基因置换、基因修饰、基因干预、自杀基3.因治疗、免疫基因治疗等基因治疗的方法主要包括（1）将正常基因导入病变细胞，表达产物参与细胞代谢。（2）将反义核酸导入病变细胞，抑制致病基因的过度表达。（3）将特定基因导入非病变细胞，表达特定产物，发挥治疗作用。基因治疗的一般步骤包括（1）选择和制备正常基因；（2）选择基因治疗的靶
4、细胞；（3）将治疗性基因导入细胞；（4）转染细胞筛选和正常基因鉴定1 .如何分别从DNA,mRNA和蛋白质水平上Knockdown基因的表达。提示：DNA水平可以从启动子着手，突变启动子或修饰启动子使其沉默，或者阻断与其结合的转录因子活性；RNA水平是采用RNA干扰实验最好；蛋白质水平是用抑制剂或抗体或负显性（Dominantnegative,也就是过表达某结构正常但没有活性蛋白，从而竞争性抑制内源正常蛋DNA水平上：(1)基因突变：DNA甲基化；基因重排，例如置于一个沉默子之中(2)影响转录：原核生物上，突变启动子或修饰启动子使其沉默；阻断b因子与启动子结合或抑制其活性。真核生物上，阻断转录
5、因子的活性，使RNA聚合酶无法转录基因，使基因表达受到抑制等等。(3)RNA生物合成抑制剂：碱基类似物，核昔类似物，模板干扰剂，RNA聚合酶抑制剂。RNA水平上：改变mRNA的稳定性，从而影响翻译效率；使5非翻译区长度小于12nt,;翻译起始因子磷酸化利用RNA干扰技术，介导基因沉默：miRNA与含有同源序列的mRNA结合，阻遏其翻译或促进其降解，产生基因沉默效应。小干扰RNA能与目的基因mRNA结合,促进其降解，产生基因沉默效应。蛋白质水平上：(1)阻断或抑制蛋白质加工后的修饰；促进翻译阻遏蛋白(2)蛋白质生物合成抑制剂：直接抑制蛋白质合成的抗生素。(3)促进蛋白质泛素化，加快降解。(3)介
6、导蛋白质的负显性：过表达某些结构正常但没有活性的蛋白，从而竞争性的一直内源正常蛋白。2 .简述PCR引物设计原则。(1)引物定位基因组DNA引物序列应定位于保守序列区域，且在其它区域没有同源序列(序列同源性一般不超过70%);cDNA引物序列应尽量位于编码区内，断裂基因cDNA上游引物和下游引物应尽量定位于不同外显子内。(2)引物长度控制在1040nt,多数2030nt(3)引物的末端3端与模板严格互补，特别是末端的两个核甘酸，最好是S(即G或C),但不能有连续的3个S。对大引物而言，5端序列不必严格互补，甚至可以修饰。1I(4)引物组成G和C含量应控制在40%75%。(5)引物序列引物之间不
7、能存在互补序列，特别是3端不能互补。引物内部不能存在可导致形成发夹结构的反向重复序列。引物所含单核音酸重复序列长度不能超过5nt。(6)引物熔点引物熔点Tm=2(A+T)+4(G+C)。引物熔点应该一致(相差不超过5C)。3 .根据被测定的对象，简述分子杂交印迹的种类及其特点、应用上优缺点。分为DNA印迹法和RNA印迹法。DNA印迹法还包括斑点印迹法、夹缝印迹法、菌落杂交法和噬菌斑杂交法。由此衍生的有蛋白质印迹法。1)、DNA印迹法，要先电泳后变性、转移。RNA印迹法为先变性后电泳、转移。2)、RNase(核糖核酸酶)无处不在，可以将RNA降解为核音酸，因而从制备RNA到分析都要绝对消除外源R
8、Nase的污染，并尽量抑制内源性RNase。DNA印迹法则无此要求。3）、RNA印迹法不能采用碱变性，因为采用碱变性会导致RNA水解，所以只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亚碉等变性。（RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一种特异RNA,特别是分析mRNA的长度和含量。）4）、斑点杂交法和夹缝杂交法的特点是用样量少、操作简便，提取的核酸不需要进行电泳和转移，但在同一张固定膜上可以点多个样本。5）、蛋白质印迹法也是由电泳分离、转移固定和检测分析等组成。只能用电转移法进行转移。用抗原-抗体反应检测目的蛋白.简答题1.克隆（筛选、测序、扩增、验证）疾病相关基因的方法。（1）定位克隆的
9、策略（2）消减杂交的策略隆（筛选测序扩增验证）疾病相关基因的方法。筛选疾病相关基因（基因芯片，扣减杂交，蛋白质组学）利用基因芯片筛选相关基因。基因芯片也称DNA芯片，基于核酸分子杂交，专以检测核酸。基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量检测DNA的技术。其基本原理是：将大量已知序列的DNA片段作为探针按照一定的阵列高密度固定于基片表面，阵列的每一点代表一种特定基因，然后与用荧光素标记的待测核酸进行杂交。用专门仪器检测芯片上的杂交信号，经过计算机分析处理，获得待测核酸的各种信息。基本操作过程为：芯片制备一样品制备一分子杂交一检测分析利用扣减杂交法筛选疾病相关基因：扣除杂交法的本质是除去那些普
10、遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高分离的敏感性。消减杂交：是将实验组mRNA与对照组cDNA杂交，除去杂交体和未杂交cDNA之后得到实验组mRNA,以分析仅在实验组表达的基因。利用蛋白质组学法筛选疾病相关基因：以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究细胞内所有蛋白质的组成、结构及其代谢规律的科学。所有疾病在表征显示之前已经有一些蛋白质发生了变化，寻找疾病相关基因，特别是标志蛋白，对于疾病基因筛选具有重要意义。蛋白质组学研究是寻找疾病标志蛋白最有效的方法。测序Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。扩增目的基因(1
11、)PCR,多聚酶链式反应。PCR是核酸体外扩增的核心技术，包括变性、退火、延伸三个基本步骤。变性：根据DNA高温变性的原理，将反应体系温度升至94c98C，使双链目的DNA解离成单链，便于作为模板与引物结合、退火：将反应体系温度降至50C65C,此时序列互补的单链DNA可以结合形成双链结构，为下一步延伸做好准备。延伸：将反应体系温度升至70c75C,DNA聚合酶遵循碱基互补配对原则在引物3端以5一3方向催化合成目的DNA模板新的互补链。以上三个步骤构成PCR循环，循环进行即可扩增目的基因。其中，需要TaqDNA聚合酶，寡核甘酸引物，Mgcl2,dNTP和DNA模板。验证.gainandloss
12、。利用基因打靶技术，用基因敲除使目标基因某些序列loss,或用基因敲入使目的基因gain,然后将重组的目标基因通过同源重组转化后筛选出阳性纯合子，最后诱导目的基因的表达，观察纯合子是否依然患病，从而判断目的基因与疾病的关系。2 .谈谈你对转基因食品的看法3 .简述原癌基因、癌基因、抑癌基因的作用，及它们与细胞周期、细胞凋亡调控基因的相互关系。(1)原癌基因：又称细胞癌基因，是存在于正常细胞基因组中的一种正常基因，其功能是调控细胞生长和变化，癌基因：是原癌基因激活后成为癌基因，是导致肿瘤发生的重要分子基础，其编码的产物可以在动物体内引起肿瘤的发生，使培养细胞发生恶性转化。1）、ras基因：ras
13、是第一个在人体肿瘤内被鉴定的癌基因。一些生长因子通过RIK或PIK途径激活Ras蛋白，由Ras蛋白激活Raf和PI-3K途径调控细胞增值和凋亡。2）、mycMyc是细胞生长和分化的促进因子，高水平的Myc可以促进细胞生长和推动细胞周期。3）、bcl-2一些原癌基因产物就是Cyclin一些原癌基因产物诱导Cyclin表达一些原癌基因产物调节CDK活性，从而调节细胞周期和细胞凋亡。（2）抑癌基因：是一类存在于正常细胞中调控细胞生长的基因，具有潜在的抑癌作用。1）、Rb（RB1）:是第一被鉴定和克隆的抑癌基因。在G1期，低磷酸化的Rb蛋白（是细胞周期抑制信号的集合点）通过对转录因子E2F的作用，使细
14、胞停滞于G1期，起到调控细胞增值和分化的作用。2）、p53（TP53）1?生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖过程,中起重要作用。促进DNA修复。3、p16蛋白既是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子。抑制CDK4，使Rb蛋白保持低磷酸化，抑制细胞从G1期向S期的过渡，另外还可以通过稳定抑癌蛋白P53而抑制细胞增殖。I4.试述人类基因分级表达调控（DNA层面，RNA层面，蛋白质层面）。色体：1、染色质结构改变通过改变DNA分子的压缩程度，形成异染色质或常染色质从而影响基因的转录效率；2、组蛋白化学修饰组蛋白通过甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰，导致正电荷减少，而出
15、现构象改变，与DNA亲和力降低，使染色质变疏松，利于引发转录3、染色质丢失DNA:1、DNA甲基化DNA甲基化导致染色体结构改变，同时影响DNA与蛋白质的相互作用2、基因重排3、DNA扩增细胞内单独复制某一个或某一组基因，增加基因的拷贝数，从而促进基因表达RNA:1、mRNA转录后的加帽和加尾，以增加mRNA的稳定性2、siRNA和miRNA通过RNAi机制使mRNA翻译抑制，干扰基因表达蛋白质：1、各类调节蛋白通过数量、化学修饰、变构、蛋白质-蛋白质相互作用等方式调节基因表达2、泛素-蛋白酶系统活性选择题：1 .DNA复制的特点：半保留复制、有一定的复制起始点、需要引物、双向复制、半不连续复制2 .转录启动子特点3 .核糖体rn和rRNA,是细胞内含量最多的一类RNA,也是3类RNA(tRNA,mRNA,rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA,它与蛋白质结合而形成核糖体，其功能是在mRNA的指导下将氨基酸合成为肽链4 .引物酶：引物酶是合成一小段RNA,用来引导DNA聚合酶起始DNA链的合成。引物酶需引发前体护送才能催化引物合成5 .基因探针：小段单链DNA6 .与细胞凋亡直接的细胞器：溶酶体7 .常见的癌基因H-ras、K-ras和N-ras是在人类肿瘤中最常见的癌基因还有sis家族的sis基因，HER
