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1、一、 形态学观察方法二、 1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。三、 2、丫啶橙（ AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。四、 3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。五、 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，
2、胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。六、 二、 DNA凝胶电泳七、 （一）、检测原理八、 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现 DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现 180 200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。九、 （二）结果判断十、 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。十一、三、酶联免疫吸附法（ELISA) 核小体测定十二、凋亡
3、细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA 法检测。十三、（一）检测步骤十四、1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；十五、2、在微定量板上吸附组蛋白体十六、3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合十七、4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合十八、4、加酶的底物，测光吸收制。十九、（二）用途二十、该法敏感性高，可检测5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。二十一、四、流式细胞仪定量分析二十二、（一）检测原理
4、二十三、细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。二十四、（二）应用价值二十五、流式细胞仪检测具有以下特点：二十六、1) 、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确二十七、2) 、可以做许多相关性分析二十八、3) 、结合被检测细胞的 DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期二十九、检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI 双染色法三十、细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这
5、一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。三十一、利用 Hoechs-PI 染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI) 而呈强的红色荧光。三十二、DNA片断原位标记法三十三、凋亡细胞 DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（ deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后 3的羟基（ OH）端结合，经显色反应
6、后检测DNA裂解点的技术。三十四、DNA片段原位标记法有二种：三十五、1、原位缺口转移（ in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用 DNA多聚酶 I 将标记的核苷酸连接到断裂 DNA的 3 OH端三十六、2、原位缺口末端标记技术（ in situ end labelling technique,ISEL)，即 TUNEL法，它是利用 TdT 将标记的 DUPT接到 3 -OH 端。研究证明， TUNEL法的敏感性远高于 ISNT，尤其对早期凋亡的检测， TUNEL更为合适。三十七、检测细胞膜成分变化的Annexin V联合PI法三十八、1、原理：在细胞凋亡早期
7、位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白 V（Annexin V ）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS 具有高度的结合力。因此， Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS 有高度亲和力的Annexin V ，将Annexin V 标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用 PI 拒染法（因坏死细胞 PS 亦暴露于细胞膜外测，且对 PI 高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。三十九、2、结果判断：正常活细胞Annexin V、 PI 均低染；凋亡细胞 Annexin V高染、 PI 低染；坏死细胞 A
8、nnexin V/PI 均高染。四十、3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS 外露早于 DNA断裂发生，因此Annexin V 联合 PI 染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又 Annexin V 联合 PI 染色不需固定细胞，可避免PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的 DNA片段丢失。因此， Annexin V 联合 PI 法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)的配制贮存液： 70%酒精溶解，浓度100 g/ml ，配好后用锡纸包起来，避光，可在 4 摄氏度下长
9、期保存。使用浓度：贮存液用 1xPBS稀释 1000 倍，最终浓度 100 ng/ml 。10x PBS 的配制80 gNaCl2 gKClg无水 Na2HPO42 g无水 KH2PO4加水到 1000ml贮存液可根据需要用蒸馏水稀释荧光封片液mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，染色与观察：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色 10 分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长 360-400nm.注意事项：DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核Lyso-Tracker Red是一种溶酶体
10、 (lysosome) 红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。Lyso-Tracker Red为采用 Molecular Probes公司的 DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(NeutralRed)和吖啶橙 (AcridineOrange) 也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。按照 1:20000 的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。可用于家蚕脂肪体细胞autophage 监测。见李胜文章。
