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1、第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。1.组织匀浆的制备通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。细胞
2、破碎方法有：（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。2.细胞的破碎除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有：（1）反复冻融法：-20冷冻，3037融化（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠3.免疫球蛋白片段的制备五种免疫球蛋白都具抗原性，皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分
3、辨力更高的特异性抗血清。制备方法有：（1）非共价键解离法：改变pH环境或用变性剂（2）共价键解离法（3）溴化氰裂解法（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶.木瓜酶可将IgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段；胃蛋白酶可将IgG裂解成F（ab）2个片段及数个小片段；胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。（二）可溶性抗原的提纯和纯化1.超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。2.选择性沉淀法：选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。核酸去除法、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法。其中盐析法是最常被采用，通过硫酸铵使蛋白抗原进行初筛，提取
4、丙种球蛋白及进行抗原浓缩。3.凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。4.离子交换层析法：根据所带电荷不同进行纯化分离。5.亲和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。6.电泳法：蛋白质在同一pH环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。（三）纯化抗原的鉴定1.蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度（A）值。2.分子量测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、凝胶过滤法等。3.纯度鉴定采用醋酸纤维膜电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析法等。4.免疫活性鉴定采用双向免疫扩散法、免疫电泳法或ELISA法等。三、半抗原
5、性免疫原的制备半抗原指只具有抗原性而无免疫原性的物质。多见于分子量小于4000的有机物质。半抗原与载体相结合具有免疫原性。（一）载体1.蛋白质：以牛血白蛋白最常见2.多肽聚合物：常用多聚赖氨酸3.大分子聚合物和某些颗粒聚乙烯吡咯烷酮、药用炭、羧甲基纤维素等皆常用。（二）半抗原与载体的连接方法1.物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原。2.化学方法：通过功能基团将半抗原与载体连接。（三）半抗原性免疫原的鉴定20个以上半抗原连接在一个载体分子上，才能有效刺激免疫动物产生抗体。第二节免疫佐剂一、佐剂的种类1.化合物：包括氢氧化铝、矿物油、吐温-80、弗氏不完全佐剂（羊毛脂与液状石蜡的混合物）以及人工合成
6、的多聚肌苷酸：胞苷酸、脂质体等。2.生物制剂：经处理改造的细菌及其代谢产物，如卡介苗、脂多糖（LPS）和类脂A、源于分枝杆菌的胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白等。最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂加卡介苗）和弗氏不完全佐剂两种。使用时加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原与佐剂形成油包水乳剂。佐剂和抗原的比例为1:1。乳化的方法有两种：研磨法。搅拌混合法：本法优点是无菌操作，节省抗原或佐剂，且可用此注射器直接注射。缺点是不易乳化完全。二、佐剂的作用机制1.改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；2.刺激单核-巨噬细胞系统，增强其处理
7、和提呈抗原的能力；3.刺激淋巴细胞增殖和分化；4.改变抗体的产生类型和诱导迟发型超敏反应。第三节抗血清的制备抗血清的制备是将制备好的免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。采集动物血液，分离含有抗体的血清，即为抗血清。一、免疫动物的选择常用的有家兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。1.抗原来源与动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。2.抗体需求量大时，可选用马、绵羊等大动物。抗血清需求量少时，可选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。3.抗血清分为R型和H型抗血清来源合适范围用途
8、R型家兔等小动物较宽诊断试剂H型马等大动物较窄免疫治疗4.对于蛋白质抗原大部分动物皆适合，常用的是山羊和家兔。在某些动物体内有类似物质时，蛋白质抗原对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类对山羊，免疫后均不易产生抗体。二、免疫程序1.免疫原的剂量：由免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间确定。免疫原剂量过大或过小都可使动物产生免疫耐受，在一定剂量范围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。2.免疫途径：有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径。皮内或皮下免疫时一般采用多点注射。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射。宝贵抗原可选择淋巴结内微量
9、注射法。3.间隔时间：第1次与第2次免疫间隔时间以1020天为好，第3次及以后的间隔一般为710天。三、动物采血法动物经免疫35次后，如抗血清鉴定合格，应在末次免疫后57天及时采血。目前较常用的动物采血方法有3种：颈动脉采血法；心脏采血法；静脉采血法。动物采血后，应尽快分离血清，分离血清的方法常采用室温自然凝固，然后置37或4使血块收缩后，收集血清。第四节抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定1.抗体特异性的鉴定 常用双向免疫扩散法。观察沉淀线，若粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，则证明动物已产生单价特异性抗体；若纯化抗原出现一条，而粗抗原出现多条线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀
10、线相连接，也是成功的免疫，待取血后将杂抗体吸收去除，可以成为单价特异性抗体。若不出现沉淀线，表示免疫失败。2.抗体效价的测定 颗粒性抗原采用凝集试验，可溶性抗原采用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。测定抗体效价有两种稀释方法，一种是将经过系列稀释的血清分别与一个浓度的抗原反应；另一种是同时稀释抗原和抗血清，分别与不同浓度的抗血清进行双向免疫扩散试验（称为棋盘滴定）。3.抗体纯度的鉴定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向免疫扩散试验、免疫电泳等。4.抗体亲和力的鉴定二、抗血清的保存1.28保存：用于短期保存；2.冷冻保存：是常用的抗体保存方法。将抗体分为小包装，在-80-
11、20保存，一般可保存5年，效价不会明显下降，但应避免反复冻融；3.真空干燥保存：用真空冻干机进行干燥，封装后可长期保存，一般在冰箱中可保存510年。第五节抗血清的纯化抗血清纯化的目的是除去不相关成分，防止抗血清中的其他杂抗体干扰试验结果。最常见的是提取抗血清中的特异性IgG或单价抗体。一、特异性IgG抗体1.盐析法多采用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。2.凝胶过滤法血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法，该法过滤条件温和，不影响IgG活性。常结合盐析法提取IgG，盐析法可以去除大部分杂蛋白，提高凝胶过滤法的分离效果。3.离子交换层析法4.亲和层析法二、单价特异性抗血清单价特异性是指血清只与其特异性抗原发
12、生反应。免疫得到的抗血清总是有抗白蛋白等杂抗体存在。杂抗体的去除有两种方法：1.亲和层析法2.吸附剂方法制备蛋白质抗原时破碎组织细胞最简便的是A.反复冻融法B.超声破碎法C.表面活性剂处理法D.自溶法E.酶处理法正确答案A答案解析制备蛋白质抗原时破碎组织细胞最简便的是反复冻融法。需制备10ml抗血清，应选择何种动物A.家兔B.小白鼠C.马D.绵羊E.猴正确答案A答案解析抗体需求量大时，可选用马、绵羊等大动物。抗血清需求量少时，可选用家兔、豚鼠和鸡等小动物。下列佐剂中具有免疫原性的是A.脂多糖B.氢氧化铝C.石蜡油D.羊毛脂E.多聚核苷酸正确答案A答案解析生物制剂具有免疫原性，所以具有免疫原性的
13、是脂多糖。厂家生产的抗IgG制剂一般的保存方法为A.液体4保存B.液体-10保存C.真空干燥保存D.25保存E.加叠氮钠保存正确答案C答案解析抗血清的保存：28保存：用于短期保存；冷冻保存：是常用的抗体保存方法。将抗体分为小包装，在-80-20保存，一般可保存5年，效价不会明显下降，但应避免反复冻融；真空干燥保存：用真空冻干机进行干燥，封装后可长期保存，一般在冰箱中可保存510年。最常用的半抗原载体是A.牛血清白蛋白B.牛甲状腺球蛋白C.人血清白蛋白D.人甲状腺球蛋白E.球蛋白正确答案A答案解析半抗原载体常用的有人血白蛋白、牛血白蛋白、血蓝蛋白、牛甲状腺球蛋白等。以牛血白蛋白最常用。A.盐析沉淀法B.有机溶剂沉淀法C.凝胶过滤D.离子交换层析E.亲和层析1.经典的蛋白质抗原纯化分离方法为正确答案A答案解析经典的蛋白质抗原纯化分离方法为盐析沉淀法。2.根据抗原分子大小进行纯化分离的方法为正确答案C答案解析凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。3.根据抗原所带电荷不同进行纯化分离的方法为正确答案D答案解析离子交换层析法：根据所带电荷不同进行纯化分离。
