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1、f母菌细胞融合实验一、实验目的学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定 基础。二、实验原理酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随 着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术 都有了突破性的进展。作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。这种经 溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母 体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。 这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿
2、酒业酵母。本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。酵母菌原生质体的制备一 般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。分离制备过程受许多因素的影响，如不 同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。所以整个实验过程设 计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。分离制备的原生质体在适当的再生培养基上 培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受 体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。一般来说，对数生长 期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。而不
3、同菌种的生长对数 期也略有差异，一般在1216小时之间（108细胞/ml）。制成的原生质体悬浮液在0C条 件下保存46小时，不会影响融合再生率。所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进 行，以免时间过长，影响再生。分离过程中采用的0-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细 胞壁。此外，渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16%蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。三、实验材料菌种：酿酒酵母SP-48、L-酵母：器具和试剂：恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。液体YEPD： 1000 ml分装四瓶（蛋白胨2%葡萄糖2%酵母浸膏1%自然pH值
4、）高渗YEPDS： 1000 ml （加入 kcl 52.5 g） YEPD液体培养基中加入2%琼脂PB： 2000 ml柠檬酸：21克溶于1000毫升蒸馏水中磷酸氢二钠：143.256克溶于2000毫升蒸馏水中取柠檬酸溶液678毫升 取磷酸氢二钠溶液1322毫升 混合得2000毫升PB高渗PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克PEG-CaCl:聚乙二醇6000 40克 加入至100毫升高渗PB溶液中 使氯化钙为0.4mol/l0.2% 0-巯基乙醇，无菌过滤器过滤.蜗牛酶液:1.5%蜗牛酶用高渗PB缓冲溶液配制，无菌过滤器过滤.淀粉YEPDS： 1000 ml （加入 kcl 52
5、.5 g） YEPD液体培养基中加入2%琼脂（蛋白胨2% 淀粉2% 酵母浸膏1% 自然pH值）四、实验步骤整个分离制备和再生过程于无菌条件下操作。1. 原生质体的制备：（1）菌种培养:将酵母菌sp-48和L-酵母活化转接新鲜斜面.自新鲜斜面分别挑取一环sp-48 酵母和L-酵母转接入250ml完全培养基中,30C振荡培养16-18h.（2）收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液5ml,4000r/min离心10min,弃上清液. 柠檬酸-磷酸缓冲液（PB）洗两次，收集菌体预处理：取5ml0.2%&巯基乙醇PB缓冲液于装有酵母泥的离心管中,30C保温10min, 以1000转/分离心10mi
6、n，倾去上清液（4）脱壁：在装有处理过的SP48,L-酵母菌泥的两只离心管中，分别加入5ml 1.5%蜗牛酶 -PB溶液置30C水浴中处理，取样镜检，当80%以上的细胞转变为原生质体2500r/min 离心10min,用 PB液离心洗涤，洗去酶液，加入4ml高渗PB液制成106ml以上的原生 质体液，测定形成率原生质体形成率=（酶解前菌落计数-未形成原生质体菌数）/酶解前菌落计数X100%2. 原生质体再生率测定：将制备的原生质体稀释到2-3X107个/ml，各取1ml原生质体液用PB液稀释后涂布在高 渗完全培养基(YEPDS)和完全培养基(YEPD).30C培养2天计算菌落数，酶解前的菌液直
7、接 用无菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。原生质体再生率=x 100%再生平板得总菌数-未形成原生质体菌数酶解前总菌数-未形成原生质体菌数3. 原生质体的融合：(1) .将L-酵母的原生质体用紫外线灭活2分钟,在黑暗中保存20分钟，2500rad/min 离心10min,用2ml高缓冲液悬浮.(2) .将两菌的原生质体悬浮液混合，离心，向沉淀中加入3mlPEG-CaCl2振荡均匀,230C处理20min,镜检并观察融合情况.(3) .用高深缓冲液洗涤菌体沉淀,2500rad/min离心10min.(4) .立即用高深缓冲液稀释，取融合原菌液及10-1稀释液各0.1ml菌液,涂布于再生培 养基平板上.4. 融合子的检出：融合子将融合液涂布在加有0.01%的放线菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培养基上,30C进行 培养2天,计算融合率.融合率=完全培养基平板上再生原生质体数X 100%五、实验结果1.融合子的鉴定：观察比较两亲株和融合子的细胞形态2.,计算两亲本原生质体的形成率和再生率 3.计算融合率
