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1、凝聚胺抗体筛查技术的改良【关键词】 凝聚胺；抗体筛查；微孔板摘要 目的：对试管凝聚胺法进行进一步改良，建立一种简便、快速的无须离心的微孔板凝聚胺抗体筛查方法。方法：采用自制的510微孔板代替传统的试管，省却离心等步骤进行不规则抗体筛查。结果：将传统的试管凝聚胺法同无须离心的微孔板凝聚胺法进行比较，试管凝聚胺法检测抗D、抗E灵敏度与微孔板法无差异，抗C稍高于微孔板法(1512&1256);输血前筛查200份标本，同时发现2例不规则抗体，分别为抗D和抗M；对以前鉴定的11例不规则抗体，两者都漏检了抗Jka，其他完全一致。结论：无须离心的微孔板凝聚胺法无须试管及离心设备，具有简便快速、经济有
2、效等特点，是一种可行的抗体筛查方法。关键词 凝聚胺；抗体筛查；微孔板Antibody Screening without a Centrifuge with Modified Polybrene Microplate PolybreneAbstract:Objective To establish a rapid and simple microplate Polybrene method without acentrifuge for antibody screening.Methods Modify the traditional tube Polybrene method,anddesi
3、gn a special 510 microplate instead of traditional tube,without a centrifuge for antebodyscreening.Results Compared the tube Polybrene method with the microplate Polybrene method,the efficiency has no difference:antiD was 1 024 and antiE is 512,there were some difference about antiC,the former is 51
4、2,the later is 256.The antibody screening results were the same.Conclusion The microplate Polybrene method without a centrifuge was simple,rapid,economic and efficient method,whats more,which dont need tubes and centrifuging and it is feasible method for routine antibody screening.Key words：Polybren
5、e；Antibody screening；Microplate人类红细胞血型非常复杂，到目前为止已发现25个血型系统，包括近270个红细胞血型抗原，除了我们最常见的ABO、Rh血型系统外，还有P、MNS、Lewis、Duffy、Diego、Kidd等血型系统1。人们可通过输血、注射、血型不合的妊娠或血液制品的免疫刺激和一些无察觉的刺激，产生ABO血型系统以外的不规则抗体。采用一种有效的不规则抗体筛选方法对患者及献血者进行抗体筛选，对预防不规则抗体引起的免疫性输血反应非常重要。目前进行抗体筛选常用的方法主要有以下几种：凝聚胺试管法、手工抗球蛋白法和微柱凝胶法，其中手工抗球蛋白法由于操作繁琐，费时
6、长，难以作为日常抗体筛选的常规方法，尤其难以进行大量检测；微柱凝胶法由于价格昂贵，目前国内经济上难以接受；凝聚胺试管法与其他方法比较具有灵敏、准确、操作简便、快速(只需3 min5 min)等优点，文献报道凝聚胺法对Rh、Daffy系统抗体检测敏感性高于抗球蛋白法100倍。目前有采用传统的凝聚胺法进行不规则抗体筛选的报道，一致认为，采用该方法进行不规则抗体筛选简单、快速、准确、省时，是有效可行的24。Marie Lin5建立了一种无须离心的玻片凝聚胺法交叉配血，笔者在实验过程中发现，采用玻片法混匀样品时，样品很容易溢出玻片，导致检测失败，经常需要重复检测，而且很容易造成污染。本研究在玻片凝聚胺
7、法的基础上进一步改进，采用自制的510微孔板，建立了一种无须离心的微孔板凝聚胺法进行抗体筛选，该方法保持了传统凝聚胺试管法的优点，同时省却了离心，适合大量操作，现报道如下。1材料凝聚胺试剂盒(台湾贝索产品)；不规则抗体筛选细胞和鉴定细胞(上海生物医药有限责任公司)；抗球蛋白试剂、抗D、抗E、抗C(英格兰诊断试剂公司)；510微孔板(见图1)委托本地塑胶公司制备；细胞洗涤离心机日本KUBOTA产品。2方法无须离心微孔板凝聚胺法分为三个阶段。致敏阶段：标记好微孔板，每行设计1个阳性对照，1个阴性对照。每孔分别加入2滴待检血清或标准血清，1滴10的标准红细胞或待检红细胞，然后加入3滴低离子液，用手工
8、混合，室温放置1 min。凝集阶段：每孔加入1滴01Polybrene工作液，手工振荡混合，或者采用振荡仪混合2 min，可见所有的标本都出现凝聚。重悬阶段：加入1滴重悬液，采用手工轻轻振荡混合，或者采用振荡仪混合30 s，至阴性对照非特异性凝聚消失。手工凝聚胺方法按照试剂盒说明书操作。3结果3.1致敏阶段结果见图2（略）。3.2凝集阶段结果见图3，可见所有孔的红细胞都出现凝集。（略）3.3重悬阶段结果3.4灵敏度检测手工凝聚胺法同无须离心的微孔板凝聚胺法两种方法灵敏度比较，见表1。表1手工凝聚胺法同无需离心的微孔板凝（略）35输血前检查我们对送检的200个交叉配血标本同时采用手工及无须离心的
9、微孔板凝聚胺法进行抗体筛选，共发现两名患者血清中存在不规则抗体，分别为抗D和抗M，两者的结果完全一致。36抗体鉴定我们对已经鉴定的11例抗体标本同时采用两种方法检测(见表2)，抗Jka两种方法都没有检测出来，无须离心的微孔板凝聚胺法漏检1例抗M(该例结果为肉眼可疑)，该标本采用手工凝聚胺法也是弱凝集。进一步采用抗人球蛋白法进行抗体滴度分析，抗体滴度为14。表211例抗体鉴定阳性标本检测比较（略）注：*其中1例结果可疑，肉眼难以确定，该例未计入。4讨论血型免疫抗体在正常人群中检出率为032.0，是引起迟发性免疫性输血反应的主要原因7。我国临床输血技术规范规定：凡遇到交叉配血不合，有输血史、妊娠史
10、或短期内需要多次输血的患者必须作抗体筛选试验。美国血库协会规定(American Association of Blood Banks)：凡是输注全血及红细胞的患者都必须进行不规则抗体筛选8。为了保证输血安全，提高输血疗效，减少或杜绝溶血性输血反应的发生，对献血者及患者进行不规则抗体筛选具有重要的临床意义。本研究对传统的凝聚胺法进行进一步改进，首先增加凝聚胺液的浓度，由0.5提高到1；第二，增加重悬液枸橼酸钠的浓度，由02 M提高到04 M；第三，采用自制的微孔板代替传统的试管。传统的试管法是通过离心和凝聚胺液共同促进红细胞聚集，微孔板凝聚胺法省却离心，仅利用阳离子聚合物凝聚胺液使红细胞聚集，
11、所以增加了凝聚胺的浓度。在实验过程中，采用梯度的凝聚胺浓度进行实验(结果未显示)，发现采用浓度为1的凝聚胺液效果不错。浓度太低红细胞凝聚效果不好，浓度太高则红细胞非特异性凝聚，导致假阳性结果。在本实验中，重悬液枸橼酸钠的浓度也增加了1倍。在凝聚胺法实验中，加入重悬液的目的是中和凝聚胺所带的正电荷，恢复红细胞表面的负电荷。反应体系中加入重悬液后特异性凝集由于抗原抗体之间的亲和力，仍然保持凝集；非特异性凝聚由于红细胞表面负电荷之间的排斥作用又重新散开。我们对Rh血型系统的抗D、抗E、抗C分别采用手工和无须离心的微孔板凝聚胺两种方法进行效价测定，抗D及抗E的滴度都分别是11 024和1512，抗C手
12、工法稍高于微孔板法，前者为1512，后者为1256，差异无显著性；我们对送检的200份输血前交叉配血标本，同时采用这两种方法进行检测，共发现两名患者血清中存在不规则抗体，分别为抗D和抗M，两者的结果完全一致。对已经鉴定的11例抗体阳性标本，同时采用两种方法检测，都漏检了抗Jka，其他结果完全一致，说明凝聚胺对抗Jka 的检出能力有限9。总的来说，无需离心的微孔板凝聚胺法进行抗体筛选是有效可行的。本研究建立的无须离心的微孔板凝聚胺抗体筛查法操作上，由于无需离心，与试管凝聚胺法比较更简便，单个标本费时差异无显著性，3 min5 min内可以完成检测，但采用该方法一次可以完成大批量标本(38个，两个
13、阴性、阳性对照)，同时有利于室间质控的操作，因此与试管法比较具有明显的优势。对于输血患者进行抗体筛选，可及早发现血型免疫抗体，提前准备相合的血液，保证此类患者及时用血，避免由血型免疫抗体引起的输血反应。本研究建立的无须离心的微孔板凝聚胺抗体筛查法简便快速、经济有效，是一种非常可行的方法，适合于临床输血前及血站献血者不规则抗体筛选。参考文献：1曹奎杰，胡丽华，刘峰不规则抗体检查在临床输血中的应用J临床血液学杂志，2002，15(4)：1631642林琼琳，李建华，彭燕，等1 038例患者输血前不规则抗体筛检分析J临床输血与检验，2005，7(3)：200201.3吕先萍，汪群英，胡利亚输血前抗体
14、筛选的临床意义J医学版.郑州大学学报，2003，38(6)：9829834Marie Lin Compatibility testing without a centrifuge:the slide polybrene methodJ.Transfusion，2004，44:410413.5Lalezari P,Jiang AF.The manual Polybrene test:a simple and rapid procedure for detection ofred cell bodiesJ.Transfusion，1980，20：2062116肖普星输血技术手册M成都：四川科学技术出版社，1992：957徐忠，沈行峰血站和输血机构标准M美国血库协会第22版上海科学技术出版社，2004：518Marie Lin.Compatibility testing without a centrifuge:the slide polybrene methodJ.Transfusion，2004，44:410413.9Liu Fuping,Liu Jingchun.Possible insensitivity of the polybrene antibody screen to detectanti JkaJ.Ann Clin Lab Sci，2006，36(1):101102
