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1、枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化LIU Wenlong;WANG Xingji;WANG Kefen;WANG Shuai【摘要】选用玉米粉、豆饼粉、KH2 P04及Na2 HP04为基础配方，通过单因素 实验对枯草芽孢杆菌发酵产中性蛋白酶的培养基组分及培养条件进行优化.确定了 优化的发酵培养基为：20 gL-1甘油,30 gL-1豆饼粉,2 mmolL-1氯化钙,0.3 gL- 1 KH2 PO4,4 gL-1 Na2 HP04；优化的发酵条件为:温度30C,接种量5%.调控发 酵培养基pH值7.0控制发酵，发酵周期40 h,最终的酶活达到7344 UmL-1.进行 甘油补料流加实验，
2、培养温度30C,发酵过程控制pH值7.0,调整转速和风量控制溶 氧30% 35%,接入5%种子，经过40 h发酵,最终酶活达到10654 UmL-1,较未 补料提高了45 % .期刊名称】 化学与生物工程年(卷),期】 2019(036)001【总页数】6页(P47-52)【关键词】 枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；液体发酵；酶活性【作者】 LIU Wenlong；WANG Xingji；WANG Kefen；WANG Shuai【作者单位】 ；【正文语种】 中 文蛋白酶是一类在生理及商业上都有非常重要地位的水解酶类，能催化肽键水解成氨基酸或短肽，其销售量约占酶制剂市场的一半以上1。按蛋白酶作用的最
3、适pH 值可分为酸性、中性和碱性蛋白酶。中性蛋白酶是最早被应用的蛋白酶之一，能在中性pH值范围内将大分子蛋白质水 解成相对分子量在5 000以下的多肽2，普遍存在于细菌和真菌中，在pH值 78时活性最大3。目前，中性蛋白酶高产菌株主要通过自然界筛选、人工诱变 和分子生物学改造获得4-8。近年来，国外研究侧重于基因结构特性研究、定点 突变改变蛋白酶的特性、稳定性的提高、与医学相关的蛋白酶的分离鉴定、蛋白酶 的应用等9-12。市场销售的中性蛋白酶的主要生产菌种包括细菌类的枯草芽孢杆 菌、耐热解蛋白芽孢杆菌，真菌类的寄生曲霉菌、灰色链霉菌、栖土曲霉菌、米曲 霉菌等13，其中枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶是
4、市场销售最广泛的中性蛋白酶。枯 草芽孢杆菌产中性蛋白酶具有发酵周期短、安全性好、酶活高等特点。枯草芽孢杆 菌产中性蛋白酶的酶分子中的2 3个酪氨酸和1个组氨酸残基同锌原子一起表现 酶的活性，同时1个色氨酸和几个钙原子在维持酶的构象上有重要作用。中性蛋白酶被广泛用于食品和烹饪行业14、丝绸、饲料工业15。工业化生产的 中性蛋白酶主要由微生物经液体深层发酵和固体发酵制得，其中液体深层发酵因操 作条件可控而应用较广泛。在液体发酵过程中蛋白酶直接由细胞产生分泌到培养液 中，属于胞外酶。因发酵液中含有多种物质，为得到高酶活的中性蛋白酶及降低生 产成本，不仅需要提高发酵水平，而且还要对发酵液进行提取分离1
5、6。产蛋白酶菌株的培养基主要成分包括碳源、氮源、金属离子等17-18。细菌产中 性蛋白酶按其催化机制属于金属蛋白酶，因此无机盐的浓度对产酶会有很大影响 19。结合目前行业的发展状况，作者采用枯草芽孢杆菌生产中性蛋白酶，对其发 酵培养基、培养条件及发酵条件进行优化，旨在提高该菌株的发酵水平，降低生产 成本，为后续试验及扩大化生产提供帮助。1 实验1.1 菌种与培养基枯草芽孢杆菌：实验室筛选保藏菌种。斜面培养基(gL-1):牛肉膏5，胰蛋白胨10,氯化钠10,琼脂18 , pH值7.5。 种子培养基(gL-1):酵母粉5，蛋白胨5，氯化钠10，pH值7.5。发酵培养基(gL-1):玉米粉30,豆饼
6、粉30, KH2PO4 0.3 , Na2HPO4 4 , pH值 自然。固体平板培养基(gL-1):脱脂奶粉14，酵母粉1.5，琼脂18。1.2 培养方法将种子接于斜面上，30 C下培养48 h ;挑取斜面活化菌体到25 mL种子培养基 中,30 C、220 rmin-1培养10 h,以3%的接种量转接到50 mL/250 mL的种 子培养基中,30 C下发酵培养；以5%的接种量接到含18 L发酵培养基的30 L 发酵罐中,30 C下培养。1.3 中性蛋白酶酶活的测定按照GB/T 23527-200920采用福林酚法测定。酶活力单位定义：1 mL液体酶在40 C、pH值7.5的条件下，1 m
7、in水解酪蛋白 产生1 pg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以UmL-1表示。1.4 菌体生物量的测定取发酵液1 mL,采用梯度稀释的方法，在固体平板上30 C下培养，进行3组平行实验,菌落计数。2 结果与讨论2.1 发酵培养基主要成分的优化培养基对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物的积累都有很大的影响。另外,在 发酵工业中,培养基需求量很大,配制培养基应尽量利用廉价易得的原料,以降低 成本。本实验对枯草芽孢杆菌液态发酵产中性蛋白酶发酵培养基的主要成分及配比 进行优化。2.1.1 碳源对产酶的影响 将发酵培养基中的玉米粉分别用葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、甘油、马铃薯淀 粉、红薯淀粉替换，其它成分
8、不变，于30工、220 rmin-1培养，测定发酵液上 清中性蛋白酶酶活，结果如图1所示。图1碳源对中性蛋白酶酶活的影响Fig.1 Effect of sole carbon source on neutral protease activity由图1可知，碳源对酶活的影响较大，其中以甘油为碳源时，酶活最高，为3 214 UmL-1,其次为玉米粉、蔗糖、马铃薯淀粉、乳糖、葡萄糖、红薯淀粉、玉米淀 粉。以葡萄糖为碳源时，酶活较低，因为葡萄糖作为快速利用碳源，在培养基中含 量过多会对产酶有抑制作用。以甘油、蔗糖为碳源时，酶活相对较高，表明微生物 利用这两种碳源较好，反馈抑制较小。玉米粉也可促进菌体
9、产酶，原因是玉米粉含 有多种微生物需要的营养成分，能促进中性蛋白酶的生成。因此，选择甘油为优化 发酵培养基的碳源。2.1.2 甘油浓度对产酶的影响以甘油为发酵培养基的碳源，将甘油浓度按梯度设为10 gL-1、20 gL-1、30 gL-1、40 gL-1、50 gL-1,其它成分不变，进行发酵实验，测定发酵液上清中 性蛋白酶酶活，以相对酶活来表示酶活大小，最大酶活设为100% ，结果如图2所 示。图2甘油浓度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.2 Effect of glycerin concentration on neutral protease activity由图2可知，甘油浓度为20 gL
10、-1时，酶活达到最高，较浓度为30 gL-1高了5%，甘油浓度过低或过高都会对产酶有很大影响。微生物代谢需要足够的碳源， 其浓度较低导致微生物利用不充分，影响生长代谢，进而影响产酶；浓度过高则提 高了微生物外部环境的渗透压，细胞脱水，导致细胞受损或死亡，形成代谢阻遏， 抑制产酶。因此，选择优化发酵培养基的碳源甘油浓度为20 gL-1。2.1.3 氮源对产酶的影响 将发酵培养基中的豆饼粉分别用硝酸钠、大豆蛋白胨、硫酸铵、蛋白胨、胰蛋白胨、 酵母粉、玉米浆替换，其它成分保持不变，于30工、220 rmin-1培养，测定发 酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图3所示。图3氮源对中性蛋白酶酶活的影响Fig
11、.3 Effect of sole nitrogen source on neutral protease activity由图3可知，无机氮源与有机氮源对酶活影响区别很大，无机氮源硝酸钠、硫酸铵对酶活影响较小，酶活处于较低水平；有机氮源对酶活影响较大，影响大小依次 为：豆饼粉酵母粉大豆蛋白胨蛋白胨胰蛋白胨玉米浆。豆饼粉作为氮源时， 酶活达到最高，为3 127 UmL-1。因此，选择豆饼粉为优化发酵培养基的氮源。2.1.4 豆饼粉浓度对产酶的影响选取豆饼粉为发酵培养基的氮源，将豆饼粉浓度按梯度设为10 gL-1、20 gL-1、 30 gL-1、40 gL-1、50 gL-1,其它成分不变，进
12、行发酵实验，测定发酵液上清 中性蛋白酶酶活，以相对酶活来表示酶活大小，最大酶活设为100% ，结果如图4 所示。图4豆饼粉浓度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.4 Effect of soybean cake powder concentration on neutral protease activity由图4可知，豆饼粉浓度为30 gL-1时，酶活最高，表明此浓度利于产酶。因此， 选择优化发酵培养基的氮源豆饼粉浓度为30 gL-1。2.1.5 无机盐对产酶的影响 在优化发酵培养基碳源、氮源的基础上添加无机盐进行发酵实验，分别添加1 mmolL-1的硫酸锌、硫酸镁、硫酸锰、氯化钙、氯化钠、硫酸亚
13、铁于优化发酵培 养基中，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图5所示。图5无机盐对中性蛋白酶酶活的影响Fig.5 Effect of inorganic salt on neutral protease activity 由图5可知，对酶活影响最大的是氯化钙，其次是硫酸镁，其它无机盐(金属离子) 对产酶都有不同程度的抑制作用。可能是因为，豆饼粉中已含有微生物生长代谢所 需要的少量无机盐离子，盐离子过多会抑制菌体代谢。采用不同浓度的氯化钙及硫酸镁进行发酵实验，考察其对酶活的影响，用相对酶活 表示不同浓度盐离子(Ca2 +、Mg2+)对酶活的作用大小，对照为未添加这2种离 子的发酵培养基，结果如图
14、6所示。图6不同浓度Ca2+和Mg2+对中性蛋白酶酶活的影响Fig.6 Effect of different concentrations of Ca2+ and Mg2+ on neutral protease activity 由图6可知，2 mmolL-1的Ca2+和Mg2+对酶活的影响较大，均高于对照组， 表明添加一定量的Ca2+或Mg2+对产酶有一定的促进作用，Ca2+的促进作用更 显著些。因此，确定在优化发酵培养基中添加2 mmolL-1Ca2+。2.1.6 磷酸盐对产酶的影响磷元素是菌体生长繁殖所需的重要元素，并且发酵培养基中的磷酸盐对pH值起到 缓冲作用，避免pH值短时间内迅
15、速改变。为考察优化发酵培养基中添加磷酸盐对 产酶的影响，进行两组实验，一组含有0.3 gL-1 KH2PO4、4 gL-1 Na2HPO4 , 另一组不含磷酸盐，测定酶活及菌体生物量，结果如图7所示。由图7可知，菌体生物量与酶活的变化趋势基本相同，菌体生物量的增加影响酶 活的升高。表明添加磷酸盐可以促进菌体的生长，有效提高酶活。因此，确定在优 化发酵培养基中添加KH2PO4和Na2HPO4。2.2 培养条件的优化2.2.1 培养温度对产酶的影响 培养温度在发酵过程中起着非常关键的作用，影响着微生物的整个代谢过程，分别 设置培养温度为28 C、30 C、32 C35 C、37 C进行发酵实验，测定发酵液上清中性蛋白酶酶活，结果如图8所示。图7磷酸盐对中性蛋白酶酶活的影响Fig.7 Effect of phosphate on neutral protease activity图8培养温度对中性蛋白酶酶活的影响Fig.8 Effect of culture temperature on neutral protease activity由图8可知，培养温度为30 C时，酶活最高；低于30 C时酶活较低，高于30 C 时酶活呈梯度下降。这是因为，当培养温度过低时，菌体代谢较慢，产酶量也较少； 当培养温度过高时，菌体代谢所需酶的活性降低，导致发酵减缓，从而影响酶活。 因此，选
