MDCK细胞培养技术

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1、.孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml.附件1：EDTA处理胰酶GIBCOBRLCat.#15400HEPES缓冲液1M母液GIBCOBRLCat.#15630-080D-MEM培

2、养基GIBCOBRLCat.#11965-092青、链霉素母液10,000U/mlGIBCOBRLCat.#15140-122/100ml牛血清白蛋白组分V7.5%溶液GIBCOBRLCat.#5260-037/100ml三、MDCK细胞培养技术（一）生物安全级别和生物安全规定1.MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。2.MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。（二）MDCK细胞的传代培养步骤1.细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：（1） 生长成片的MDCK细胞；（2） T-75细

3、胞培养瓶,颈口有倾角；（3） D-MEM培养液；（4） 青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000g/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20；（5） HEPES缓冲液，1M母液；（6） 胎牛血清；（7） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA4Na)（GibcoCatNo.25300-062），分装后保存于-20；（8） 牛血清白蛋白组分V，7.5溶液（GIBCOCatNo.15260）；（9） 1mL和10mL无菌移液管等；（10） 7075的酒精。建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。2.培养基和试剂的准备:（1） 500mL的D-MEM液中加入a)

4、 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100g/mL链霉素)；b) HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)；c) 7.5牛血清白蛋白组分V12.5mL。d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2） 细胞生长液10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。3.MDCK细胞的传代培养程序此处以T-75细胞瓶单层培养为例，进行叙述。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、ED

5、TA胰酶等，置37预热后，用7075酒精擦拭后放于生物安全柜内。（1） 弃去细胞已生长成片的细胞培养瓶中的培养液，加5mL37预热的EDTA-胰酶；（2） 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；（3） 重新加入5mL37预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤；（4） 加1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离（约5min10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入1mL胎牛血清中和残余胰酶的活性；（5） 加9mL细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培养瓶底部一边开始到另一边

6、结束，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽量避免出现泡沫；（6） 吹打后，瓶中加入90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞），该培养液含终浓度为10的胎牛血清；（7） 每个T-25细胞培养瓶中加6mL(6105/mL细胞)细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。通常6mL细胞悬液23日可长成80%90%的单层细胞片；（8） 于375%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25胰酶与Versene按照1:7的比例配成消化液使用。（三）细胞的冻存

7、1.细胞冻存材料（1） 成片的MDCK细胞：8090成片，细胞生长良好存活率高；（2） 二甲基亚砜（DMSO）；（3） 胎牛血清；（4） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA4Na)；（5） 无菌移液管：1mL和10mL。（6） 15mL无菌离心管2.细胞冻存步骤（1） 冻存液的制备：胎牛血清9mL；二甲基亚砜1mL。（2） 细胞消化：消化过程同细胞培养的消化过程。（3） 细胞消化后，移入15mL离心管，1000rpm，离心5min，弃上清，轻弹离心管底，重悬细胞，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。细胞冻存浓度为1106/mL细胞。（4） 常规细胞冻存过程：42h

8、，-202h，放入液氮长期保存。如使用商品化冻存盒，直接放于-80过夜，第二天从冻存盒取出，放入液氮保存。（四）细胞的复苏复苏细胞的原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。新复苏的细胞一般需要数日或继续传代12代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。1.材料（1） 37恒温水浴箱；（2） 细胞生长液；（3） 胎牛血清1mL；（4） T-25培养瓶，无菌移液管；（5） 7075的酒精；（6） 15mL无菌离心管2.细胞复苏步骤（1） 将细胞生长液放入37水浴预热，预热后以7075的酒精擦拭外壁，放入生物安全柜内；（2） 自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，避免热胀

9、冷缩过程盖子松掉；（3） 立即放入37水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全部融化，以7075的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜内；在解冻过程中，需做好个人防护，防止冻存管爆裂；（4） 取出1.0mL解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5mL细胞生长液的15mL离心管内，1000rpm，离心5min，弃去上清，用5mL细胞生长液重悬细胞，移入细胞培养瓶内，放入375%CO2培养箱培养。（五）质量控制MDCK细胞随着传代次数的增加，可能会降低其对流感病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传1520代，或总代数达到40代以上时，可以

10、用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。（六）MDCK细胞系的敏感性的检测选择已知TCID50的流感病毒，在同一条件下分别感染早代（小于30代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。四、流感病毒的分离病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗

11、原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份

12、-70或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1.流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。2.流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1.试验材料（1） 刚75-90成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2） TPCK处理胰酶（牛胰腺来源型）（SIGMAT8802）（3） HEPES缓冲液,1M母液（4） D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨

13、酰胺），Hanks液（5） 青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000g/mL硫酸链霉素)（6） 牛血清白蛋白组分，7.5%溶液（GIBCOCatNo15260）（7） 处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8） 无菌移液管：1mL和10mL2.培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1） 500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100g/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25)c) HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15

14、mL（终浓度：2-3%)（2） 病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2g/mL。3.流感病毒MDCK细胞分离程序所有有关流感病毒分离的操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。（1） 7590成片细胞的准备a) 用40倍光学显微镜镜观察细胞生长状态。选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。b) 轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸6mLpH7.4-7.6的Hanks液（或PBS缓冲液）清洗细胞3遍。（2） 接种于细胞培

15、养瓶a) 用无菌的移液管将清洗细胞的Hanks液从细胞培养瓶中移出。b) 用无菌的移液管吸取500l临床样品置于细胞培养瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培养瓶底。c) 将步骤2）中的培养瓶放入35，5%CO2培养箱中吸附12h。d) 从培养箱中取出细胞培养瓶，用10mL的无菌移液管吸取6mLpH7.4-7.6的Hanks液（或PBS缓冲液）清洗细胞，加入5mL含终浓度2g/mLTPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中。e) 放置于355%CO2培养箱培养。f) 每日观察细胞病变情况（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。（3） 细胞培养物的收获a) 当75100细胞出现病变时进行收获。即使无细胞病变也应该于第7天收获。b) 进行红细胞凝集试验(HA)，用HI方法进行流感病毒的鉴定（具体方法参见附件1：五、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验）。对于HA