《萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 实验报告》由会员分享，可在线阅读，更多相关《萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 实验报告（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定一、研究背景及目的酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。 能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。 生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。 细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分 重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。其中，淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，可以分成a -淀粉酶，B-淀粉酶等。a - 淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的a
2、-1, 4-链。 B -淀粉酶与a -淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断a -1, 4-葡聚 糖链。 根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所 催化产生的麦芽糖毫克数。3,5二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试 剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅 程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原 性糖，可用该方法对其含量进行测定。本次实验的目的在于通过实验过程，理解淀粉酶测定的原理，熟悉实验操作，掌握实验 方法。蛋白质是生物体中广泛
3、存在的一类生物大分子，它是与生命及与各种形式的生命活动紧 密联系在一起的物质，对生物来说十分重要。目前有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、 Folin-酚法、染料结合法、紫外法，最常用的是后三种。本次实验选择通过Folin-酚法测定蛋白质含量。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马 斯亮兰法所取代。二、实验原理该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的 初速度来表示酶的活力。以及通过化学反应使得蛋白质具有特异光吸收，再通过比色法测定 蛋白质含量。该实验的理论基础为：（1）酶的性质：淀粉酶
4、是蛋白质，在一定的条件下会发生钝化，可利用此性质将体系中的 非目标酶类钝化，从而测出目标酶类的活力；（2）3,5二硝基水杨酸法： 3,5二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖 和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内， 棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总 糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 具体反映为：在加热、碱性条件下：3,5 二硝基水杨酸（黄色）+还原糖一-3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红 色） +糖酸；（3）比色法原理：朗伯一比尔定律（当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的
5、吸光物 质时，与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比）。三、仪器试剂1、仪器设备：上海精宏实验设备有限公司DK-S24型40C水浴锅；天津市中环实验电炉有 限公司22列八孔型70C电热恒温水浴锅；上海安亭科学仪器厂TDL-408型低速离心机；上 海精密科学仪器有限公司722型光栅分光光度计；DCL-2000 DY型电磁炉（佛山市爱庭电 器有限公司）。2、主要实验器皿:50ml容量瓶，100ml容量瓶，研钵一套，具塞刻度试管若干，试管若干, 烧杯。3、试剂：（1）麦芽糖标准液（lmg/ml）；（2）pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（称取柠檬
6、酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；（3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3, 5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠 中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml,盖紧瓶 塞，勿使二氧化碳进入）；（4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中， 用蒸馏水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH；（6）试剂甲：（A）10 克 Na2CO3, 2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O）。 溶解于500毫升
7、蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50 份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（7）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4 2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4 2H2O） 及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以 小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫酸锂（Li2SO4）, 50毫升蒸馏水及数滴 液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须 再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用
8、标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。(8) 牛血清蛋白标准溶液(250 ug/ml)。4、实验材料：萌发的小麦种子。四、实验步骤(1) 酶液的制备(蒸馏水浸提)：称取 2 克萌发的小麦种子(芽长一厘米左右)，置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为 匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容 到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用(初始酶液)。(2) a淀粉酶活性的测定：A. 取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。B. 于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70C恒温水浴中(水浴温度的
9、变化不应超过 0.5C )准确加热15分钟，取出后迅速在水浴中彻底冷却。C. 在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液。D. 将测定管和对照管置于40C(0.5C )恒温水浴中准确保温15分钟后，向两支对 照管中各加入4ml 0.4MNaOH,再向各管分别加入40C下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即 放入40C水浴中准确保温5分钟后，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH,然后准备 下步糖的测定。(3) a-淀粉酶及B-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混均后，取4支试管，2支 为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1ml及pH5.6柠
10、檬酸缓冲液1ml,以下步骤重 复a淀粉酶测定的第D的操作。( 4)麦芽糖的测定：a. 标准曲线的制作取15ml具塞刻度试管7 支,编号，分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml) 0、0.1、0.3、0.5、 0.7、 0.9、 1.0毫升，然后将各管用蒸馏水准确补充到1.0毫升，摇匀后再加入3,5-二硝基水 杨酸1 毫升，摇匀，在沸水浴中准确保温5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释到15毫升，混 均匀后用分光光度计在 520nm 波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标以麦芽糖 含量为横坐标绘制标准曲线。b. 样品的测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1 毫升，分别放入15毫升具塞刻度
11、管中，在加入1毫升， 3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷 却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值， 根据标准曲线，进行结果计算。5)水溶性蛋白的测定A.标准曲线的测定:取 6 支大试管分别加入 0 ，0.2 ，0.4，0.6，0.8 ，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250mg/ml）。 用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，迅速混匀，于室温（2025C ）放 置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。然后在室温下放 置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照
12、，于650nm处测定各管中溶液的 吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。B.样品的测定取酶液2ml,加入6ml蒸馏水，作为待测液。按上述方法进行操作，同时进行。根据所 测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。（ 6）结果计算a -淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）=毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1（a -+B -）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）=毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1A a -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A a -淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B a-及B -淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B a-及B-淀
13、粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度五、数据整理与计算麦芽糖标准曲线：管号1234567麦芽糖标准液浓度X15（mg/ml）00.10.30.50.70.91.00D5200.0000.0240.1590.3060.4400.5420.639-U2 O1:1麦芽報脓度渭定标准曲线y = u. 5181X R2 - 0.99253 6 4CLU.1:1_C. F1麦芽糖浓度(lug/inl). F淀粉酶活力测定液:管号89101112131415项目a -对照管a -测定管a + B-对照管a+B-测定管OD5200.2180.2090.3510.339-0.008-0.0080.1330.129OD
14、520 均 值0.2140.345-0.0080.131麦芽糖浓 度 (mg/ml)0.0230.037-0.0010.014水溶性蛋白标准曲线:管号蛋白质浓度(ug/ml)501001502002500D6500.1290.2480.3690.4620.551Fulinffil标准曲线y = C. uj2:x 尺飞-0. 9-221002C0蛋口质報度（s/ml）QM- 6 4 9LCLU.1:1 _(!水溶性蛋白测定液:管号789OD6500.5100.4850.495OD650均值0.497蛋白质含量2.16%六、结果计算与讨论分析A a -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A a-淀粉酶对照管
15、中的麦芽糖浓度B a-及B -淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B a-及B-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度A=0.037mg/ml； A =0.023mg/ml； B=0.014mg/ml； B =-0.001mg/mla -淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1） = 0.56毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1；（a -+B -）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1） = 12毫克麦芽糖克-1鲜重分 钟-1;在对a + B-对照管的麦芽糖浓度进行测定时，它的消光值为负值。经查阅资料，我们认 为出现复制的原因是空白管的浓度低于所测管的浓度。根据标准曲所拟合的方程，a +B- 对照管的麦芽糖浓度为负值显然是不合理的，但是，为了保证a+B-测定管与a+B-对照管 中的浓度之差计算准确，暂且将a+B
