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1、 山东大学实验报告 2011年 11 月 2 日姓名 * 班级 * 学号 * 同组者：*科目 微生物学实验 题目 细菌芽孢染色及酵母菌的观察 组别 * 细菌芽孢染色及酵母菌的观察【实验目的】1. 学习芽孢染色法，了解芽孢的形态特征；2. 观察酵母形态及出芽方式，区分酵母菌的死活细胞；3. 学习酵母子囊孢子的观察方法。【实验原理】A、细菌芽孢染色的基本原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着
2、色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。常见的细菌芽孢形态和着生位置如下图所示：B、酵母菌形态及出芽方式观察的基本原理酵母菌是一群单细胞的真核微生物。这个词语也是无分类学意义的普通名称，通常用于以裂殖或芽殖来进行无性繁殖的
3、各种单细胞真菌。由于不同的酵母菌在进化和分类地位上的异源性，因此很难对酵母菌下一个确切的定义，通常认为，酵母菌具有以下5个特点：个体一般以单细胞状态存在；多数营出芽繁殖；能发酵糖类产能；细胞壁常含甘露聚糖；常生活在含糖类较高、酸度较大的水生环境中。单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，可在40倍显微镜下经过简单染色直接观察。酵母菌大多数采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过结合产生子囊孢子，进行有性繁殖。由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法来观察酵母菌活体形态及出芽生殖方式。出芽繁殖是酵母菌进行无性繁殖的主要方式。成熟的酵母菌细胞，先长出一个小芽，芽
4、细胞长到一定程度，脱离母细胞继续生长，尔后形成新个体。有多边出芽、两端出芽、和三边出芽。酵母菌不同类型出芽方式同时，采用美蓝染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。C、酵母菌子囊孢子观察的基本原理子囊类酵母菌是以接合产生形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。它们一般通过邻近的两个形态相同而性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起相互接触、局部融合并形成一条通道，再通过质、核配和
5、减数分裂形成4或8个子核，然后它们各自与周围的原生质结合在一起，再在其表面形成一层孢子壁，这些一个个子囊孢子就成熟了，而原有的营养细胞则成了子囊。能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需一定条件，其中麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。【实验器材】1、 菌种：枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌, 酿酒酵母7d麦氏（产孢培养基）液体培
6、养物，酿酒酵母斜面培养物。2、 溶液和试剂：a) 0.01%美蓝水溶液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水等。b) 香柏油、二甲苯3、 仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等【操作步骤】A. 细菌芽孢染色的基本原理1. 实验流程图：2. 详细步骤：a) 涂片，加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；b) 孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢
7、染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；c) 水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行；d) 复染用0.5%番红水溶液复染2min；e) 水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；f) 镜检先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。B. 酵母菌形态及出芽方式观察的基本原理1. 实验流程图：2. 详细步骤：a) 涂片在洁净盖玻片中部滴一滴0.01%美蓝水溶液，
8、按常规方法接种酵母b) 加盖玻片加盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，目的是防止气泡的产生，以免影响观察；c) 放置及镜检从接种开始计时，放置3min，然后在高倍镜（40）下观察酵母菌的形态，根据染色状态判断酵母菌的死活（由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色），寻找并观察酵母菌不同类型的出芽方式（一端出芽或两端出芽）。将酵母菌美兰浸片放置30min，再用高倍镜（40）观察，根据染色状态判断酵母菌的死活，并与3min时的情况做一对比
9、说明。C. 酵母菌子囊孢子的观察1. 实验流程图：2. 详细步骤：a) 涂片，加热干燥及固定在洁净盖玻片中央滴一滴无菌水，接种液体培养物（产孢培养基）中的酿酒酵母，然后按照常规方法加热干燥及固定；b) 孔雀绿热染，水洗按照上面芽孢染色法中孔雀绿热染的操作将涂菌部位用孔雀绿热染2.5min，然后水洗；c) 乙醇脱色，水洗用95%乙醇对涂菌部位覆盖脱色30s，然后水洗；d) 番红复染，水洗及干燥用0.5%番红水溶液对涂菌部位复染30s1min，然后水洗，自然干燥；e) 镜检将装片置于显微镜下，先用低倍镜寻找到观察部位，再用油镜观察。（可在酵母菌细胞旁观察到14个同时存在的子囊孢子）【实验结果及分析
10、】1. 绘图a) 绘图说明枯草芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的形态特征（包括芽孢形状、着生位置及芽孢囊形状等）。b) 绘图说明染色330min的酿酒酵母形态特征及出芽生殖情况。2. 实验结果记录a) 芽孢染色结果记录表： 项目菌种 芽孢形状芽孢着生位置芽孢囊形状枯草芽孢杆菌椭圆形位于菌体中央或稍偏圆形不膨大梭状芽孢杆菌圆形或卵圆形位于菌体中央，极端或次极端膨大b) 吕氏碱性美兰染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞数量变化记录表：作用时间3min30min每视野活细胞数/个20170每视野死细胞数/个13154活细胞比率93.9%31.2%结论：由统计结果可明显得到美蓝虽为温和染色剂，但长时间后菌体依然会被
11、染色剂破坏或缺水导致大量死亡。c) 酵母菌出芽状况的说明由下图（见实验图示）可清晰的看到酵母菌不同类型的出芽生殖方式，包括一端出芽，两端出芽多边出芽等，观察效果较为理想。d) 子囊孢子染色由于染色操作以及菌体的原因，未能看到大量四个聚集在一起的孢子，仅能观察到一些单个孢子或两个聚合在一起的孢子以及少数三个聚合在一起的孢子，通过观察可明显得到菌体和孢子囊呈红色，孢子呈绿色，由红色孢子囊包裹。总之酵母菌子囊孢子的观察不是很理想。芽孢(绿)菌体(红)3. 实验图示图1梭状芽孢杆菌芽孢图示(10100)图2枯草芽孢杆菌芽孢图示(10100)活细胞死细胞图3酵母菌美兰浸片法图示（3min 1040)图4
12、酵母菌美兰浸片法图示（30min 1040)一端出芽多边出芽两端出芽图5酵母菌出芽生殖图示（1040）菌体（红）子囊孢子（单生）子囊孢子（两个聚生）子囊孢子（三个聚生，绿）图7酵母菌子囊孢子（三个）图示（10100）图6酵母菌子囊孢子（单个及两个）图示（10100）【思考题】1. 根据你的观察结果，美蓝染液浓度及作用时间与酵母菌死、活细胞比例变化是否有关系？试分析原因。答：有关系，美蓝浓度越大，作用时间越长则视野中死菌比例越大。原因：一是虽然美蓝对细胞无毒，但浓度大时细胞外渗透压增大导致细胞失水，二者细胞还原能力有限，浓度高或时间较长都会对细胞结构构成破坏。2. 你在实验中是否观察到酿酒酵母的
13、子囊孢子？若未观察到，试分析原因（子囊孢子的形成与培养条件的关系）。答：酵母菌有无性生殖（出芽）和有性生殖（产生子囊孢子）两种繁殖方式，不同的培养基会导致繁殖方式不同，在麦氏培养基中营养比较缺乏而易产孢子，而酵母合成培养基中营养丰富，利于菌体以出芽方式繁殖。观察效果差可能是酵母菌由于本身生长条件而产生的孢子较少，也可能是在染色的过程中染色不到位或脱色时间过长所致。3. 为什么芽孢染色法需要进行加热？能否用简单染色法观察到细菌芽孢？答:因为与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，而加热时芽孢的通透性高，此时染液可以进入从而使芽孢着色，而简单染色法不能使芽孢染色，所以不能看到。4. 若在你的制片中仅看到游离芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。答：如果只看到芽孢，可能是：a) 菌种培养的环境太恶劣了，营养体几乎都变成芽孢了。b) 可能是给芽孢染色用水洗时没洗干净，细胞还是孔雀绿的色彩。c) 复染出现问题了，可能是复染时间不够，没染上，或是水洗的太厉害，把染液都冲走了。5. 用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等玻片冷却后再用水冲洗？答:如果直接放到水下可能会导致玻片迅速受冷破裂。第 1 页 共 9 页 微生物实验报告*
